FGF21/β-klotho/FGFR1通路在2型糖尿病局灶性腦缺血模型大鼠腦損傷中的作用機制研究

何 陽李其富黎昌炫陳瑞鵬

(海南醫學院第一附屬醫院 神經內科,?？?570000)

糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病,以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)較為常見,隨著近來人們飲食結構及生活方式的改變,發病率呈增加且年輕化趨勢,其中糖尿病各種并發癥是其致死、致殘的重要原因,危害嚴重[1-2]。近來研究顯示,糖尿病是腦梗死的獨立危險因素,T2DM患者較非糖尿病患者發生腦缺血再灌注損傷的風險高2～6倍,且糖尿病合并腦梗死發病率逐年升高,嚴重影響患者預后及生存質量[3]。盡管近來研究糖尿病加重腦梗死的機制較多,但其具體機制尚未完全闡明[4]。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)是一種新的代謝調節因子,在大腦新陳代謝、保護和認知方面發揮重要作用[5],β-klotho是一種膜蛋白,可增強FGF21與其受體FGFR1結合的親和性,輔助其完成相應特異功能,在神經系統血管內皮功能、血糖及體重等調節中發揮重要作用[6-7]。因此本研究擬探究FGF21/βklotho/FGFR1通路在T2DM局灶性腦缺血模型大鼠腦損傷中的作用機制,以期為T2DM加重局灶性腦缺血性疾病的機制研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級10周齡SD大鼠60只,體重280～310 g,購買及飼養均在北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司[SCXK(滬)2017-0011][SYXK(滬)2017-0014]。本研究經過本院動物倫理委員會批準通過(IACUC-L2018-0005)。實驗遵循3R原則,給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(貨號:RR037A)、TB Green? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(貨號:RR820A)均購自TaKaRa公司;引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成;FGFR1抑制劑PD173074(貨號:HY-10321)、FGFR1激動劑PF05231023(貨號:HY-113697)購自MCE公司;原位末端標記法(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:C1091)購自上海碧云天公司;兔源一抗anti-FGF21(貨號:ab64857)、anti-β-klotho(貨號:ab181373)、anti-FGFR1(貨號:ab173305)、anti-血小板內皮細胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecules,CD31)(貨號:ab24590)、anti-內皮素-1(endothelin-1,ET-1)(貨號:ab242440)、anti-血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體(貨號:ab32152)、anti-GAPDH(貨號:ab9485),二抗羊抗兔IgG(貨號:ab6721)均購自英國Abcam公司;FC型酶標儀、ABI 7500 RTqPCR儀購自美國Thermofisher公司;尼康55i熒光顯微鏡購自日本Nikon公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

SD大鼠常規適應性飼養1周后,根據表1造模方法進行造模處理。

表1 造模類型及方法Table 1 Model types and methods

1.3.2 實驗分組

根據表2所述,將大鼠隨機分為5組,每組12只。若造模過程中動物死亡,及時補充造模。MCAO術后24 h對各組大鼠進行神經功能缺損評分,之后從每組大鼠中隨機選取6只處死,迅速取缺血側腦組織及其周圍腦組織置于液氮中保存備用,剩余6只進行石蠟包埋固定制成石蠟切片保存備用。

表2 大鼠的分組及給藥Table 2 Grouping and administration of rats

1.3.3 TUNEL法檢測大鼠腦組織神經細胞凋亡

石蠟切片常規脫蠟至水,胰蛋白酶K 37℃孵育25 min,漂洗晾干后采用TUNEL試劑盒進行染色后于顯微鏡下觀察,隨機選取5個高倍鏡(×400)視野下陽性細胞,并計算其所占比例,即凋亡率=(陽性細胞/計數細胞)×100%。

1.3.4 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢 測 缺 血 側 腦 組 織FGF21、βklotho、FGFR1 mRNA表達

采用TRIzol提取腦組織樣品總RNA,用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。反轉錄得到cDNA,置于-20℃保存備用。采用RT-qPCR擴增FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA片段。反應體系:TB Green Premix Ex Taq II(2×)10 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O 6.0 μL。反應條件:95℃30 s;95℃5 s,61℃31 s,40個循環。FGF21、β-klotho、FGFR1及內參GAPDH的引物序列見表3。采用2-ΔΔCT法對腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA相對表達水平進行定量分析。

表3 RT-qPCR引物序列Table 3 Primer sequence of RT-qPCR

1.3.5 免疫印跡(Western blot)檢測腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1、CD31、ET-1、VEGF蛋白表達

采用蛋白抽提試劑盒提取大鼠缺血側腦組織及周圍組織總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,置于-80℃保存備用。取50 μg蛋白樣品,進行SDSPAGE電泳分離,PVDF膜轉膜,室溫封閉,添加稀釋一抗anti-FGF21(稀釋比1∶1000)、anti-β-klotho(稀釋比1∶1000)、anti-FGFR1(稀釋比1∶5000)、anti-CD31(稀釋比1∶2000)、anti-ET-1(稀釋比1∶1000)、anti-VEGF(稀釋比1∶1000)、anti-GAPDH(稀釋比1∶5000)4℃孵育過夜,TBST緩沖液洗膜,用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶5000)室溫孵育1.5 h,洗膜后用免疫印記化學發光試劑(ECL)顯色,數字化多功能圖像增強化學發光系統曝片,觀察結果并分析各蛋白灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析,以平均數±標準差(±s)表示,兩組比較采用t檢驗,多組數據比較采用單因素方差分析,任意兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠神經功能缺損評分均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠神經功能缺損評分顯著增加,PF05231023組大鼠神經功能缺損評分顯著降低(P＜0.05),見表4。

表4 各組大鼠神經功能缺損評分比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group

表4 各組大鼠神經功能缺損評分比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group

注:與Control組相比,*P＜0.05;與MCAO組相比,#P＜0.05;與T2DM+MCAO組相比,△P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.

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2.2 各組大鼠缺血側腦組織海馬神經元細胞凋亡情況比較

Control組大鼠腦組織海馬偶見神經元凋亡,與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血側腦組織海馬神經元細胞凋亡率均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血側腦組織海馬神經元細胞凋亡率顯著增加,PF05231023組大鼠缺血側腦組織海馬神經元細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05),見表5。

表5 各組大鼠缺血側腦組織海馬神經元細胞凋亡率比較(±s,n=6)Table 5 Comparison of apoptotic rate of hippocampal neurons in ischemic brain tissue of each group

注:與Control組相比,*P＜0.05;與MCAO組相比,#P＜0.05;與T2DM+MCAO組相比,△P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.

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2.3 各組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表達水平比較

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表達水平均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表 達 水 平 顯 著 降 低(P＜0.05),PF05231023組大鼠缺血側腦組織FGF21、βklotho、FGFR1 mRNA表達水平顯著增加(P＜0.05),見圖1。

圖1 各組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA表達水平比較(n=6)Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,# P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.Figure 1 Comparison of mRNA expression levels of FGF21,β-klotho and FGFR1 in ischemic brain tissue of rats in each group

2.4 各組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平比較

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05),PF05231023組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05),見圖2。

圖2 各組大鼠缺血側腦組織FGF21、β-klotho、FGFR1蛋白表達水平比較(n=6)Note.A,Protein band map of FGF21,β-klotho and FGFR1.B,Relative expression levels of FGF21,β-klotho and FGFR1 proteins.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.Figure 2 Comparison of protein expression levels of FGF21,β-klotho and FGFR1 in ischemic brain tissue of rats in each group

2.5 各組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平比較

PF05231023組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05),見圖3。

圖3 各組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平比較(n=6)Note.A,Protein band map of ET-1,CD31 and VEGF.B,Relative protein expression levels of ET-1,CD31 and VEGF.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with MCAO group,#P＜0.05.Compared with T2DM+MCAO group,△P＜0.05.Figure 3 Comparison of ET-1,CD31 and VEGF protein expression levels around ischemic brain tissue of rats in each group

與Control組比較,MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平均顯著增加(P＜0.05);與T2DM+MCAO組比較,PD173074組大鼠缺血腦組織周圍ET-1、CD31、VEGF蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05),

3 討論

糖尿病是腦血管疾病的一個重要危險因素,持續高糖可導致血管內皮細胞損傷、破裂,極易造成血管阻塞,誘發血栓及腦梗死[12]。腦缺血急性期,隨缺血時間延長,神經元凋亡細胞數顯著增加,神經元壞死與凋亡并存,壞死主要位于缺血中心區,凋亡則主要出現在缺血半暗帶[13]。本研究結果發現,與MCAO組比較,T2DM+MCAO組大鼠神經功能缺損評分顯著增加,缺血腦組織中海馬神經元細胞凋亡率顯著增加,結果與何婧等[14]發現相一致,提示T2DM可進一步加重腦缺血損傷。研究證實,血管再生可增加腦缺血后腦組織血流灌注、改善神經功能[15]。CD31又稱血小板內皮細胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1),是一種存在于血管內皮和血小板中可直觀有效反映新生血管數目和側支循環建立情況的糖蛋白,在腦缺血梗死周圍顯著增加[16-17]。ET-1是一種具有強縮血管作用的小分子多肽[18]。VEGF是由大腦中的許多神經血管細胞產生和分泌,被認為是缺血后血管生成的中樞介質[19],其表達升高與血管內皮損傷有關。本研究結果顯示,與Control組比較,與MCAO組、T2DM+MCAO組大鼠缺血組織周圍CD31、ET-1和VEGF蛋白表達顯著增加,提示局灶性腦缺血模型大鼠存在腦血管內皮損傷,而T2DM可加重腦血管內皮損傷,但關于其具體機制尚未完全闡明。

FGF家族分為7個亞族,共有22個成員,其中FGF21主要表達于肝組織,是新發現的一種脂質調節蛋白。由于FGF21與肝素的親和力較低,可以通過簡單的擴散穿透血腦屏障,對大腦具有潛在的保護作用。FGF21已被證實在大腦新陳代謝、保護和認知方面發揮重要作用[20]。FGF21通過細胞-表面受體復合體發揮代謝調節作用,該復合體由FGFR和單一跨膜蛋白β-klotho組成。

研究報道,FGF21可減輕淀粉樣蛋白和興奮性氨基酸誘導的阿爾茨海默病大鼠模型中的神經元損傷和認知缺陷[21]。創傷性腦損傷后,FGF21還可通過FGFR1/β-klotho上調PPARγ來保護血腦屏障[22]。本研究結果發現,與T2DM+MCAO組比較,FGFR1抑 制 劑PD173074可 顯 著 降 低FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA及蛋白表達水平,增加T2DM腦缺血模型大鼠神經功能缺損,促進海馬神經元細胞凋亡,增加血管內皮損傷標志蛋白CD31、ET-1表達,而FGFR1激活劑PF05231023可顯著增加FGF21、β-klotho、FGFR1 mRNA及蛋白表達水平,減輕T2DM腦缺血模型大鼠神經功能缺損,降低海馬神經元細胞凋亡,減少血管內皮損傷標志蛋白CD31、ET-1和VEGF表 達。Ye等[23]研 究發 現,FGF21激活FGFR1/β-klotho通路可明顯改善新生兒缺氧缺血性腦損傷。本研究結果結合前人發現,推測FGF21/β-klotho/FGFR1信號通路的激活可能在T2DM局灶性腦缺血進程中發揮重要保護作用。

綜上所述,FGF21/β-klotho/FGFR1通路可能是T2DM加重腦缺血損傷的重要傳遞信號通路,促進該通路激活在T2DM局灶性腦缺血模型大鼠中發揮重要保護作用。但神經凋亡機制復雜,腦缺血引起血管內皮損傷及神經凋亡過程是否還涉及其他信號通路共同參與及其與FGF21/β-klotho/FGFR1通路的上下游作用關系,有待進一步深入探究。