巴戟天調(diào)控LncRNA LIFR-AS1對(duì)乳腺癌細(xì)胞T-47D增殖、凋亡及遷移的影響

興偉 劉遠(yuǎn) 徐志峰 任伊寧

(河北省中醫(yī)院普外科，河北 石家莊 050000)

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率高達(dá)12.2%，早期乳腺癌治愈率高達(dá)86%以上，但尚缺乏早期診斷乳腺癌的有效標(biāo)志物，放化療等綜合方法治療可提高患者治療效果但患者預(yù)后很差，目前乳腺癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明，既往研究顯示金絲桃苷、芹菜素等藥物具有抗乳腺癌的作用，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明〔1～4〕。巴戟天屬于茜草科多年生藤植物，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、祛風(fēng)濕的功效，已有研究證明巴戟天具有抗腫瘤、抗氧化等藥理作用〔5〕。但巴戟天對(duì)乳腺癌的治療效果及其可能作用機(jī)制尚未闡明。長(zhǎng)鏈非編碼(Lnc)RNA白血病抑制因子受體反義RNA-1(LIFR-AS1)在乳腺癌中呈低表達(dá)并可調(diào)控細(xì)胞增殖及遷移〔6〕。但LIFR-AS1能否作為巴戟天抗乳腺癌的治療靶點(diǎn)尚未可知。本研究探討巴戟天是否通過(guò)調(diào)控LIFR-AS1而影響乳腺癌細(xì)胞T-47D增殖、凋亡及遷移。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 巴戟天(20190203)購(gòu)自亳州百川藥業(yè)有限公司；乳腺癌細(xì)胞T-47D購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000(20190412)、凋亡檢測(cè)試劑盒(20181223)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑(20181203)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄(20181103)與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)試劑(20181116)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；si-NC、si-LIFR-AS1購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 巴戟天水提取物〔7〕：稱取100 g巴戟天藥物，加水浸泡30 min后進(jìn)行煎煮60 min，過(guò)濾水煎液后再次進(jìn)行煎煮45 min，收集2次濾液并進(jìn)行減壓濃縮至體積160 ml，冷卻后放入冰箱內(nèi)孵育24 h，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心后取上清，藥物濃度為2 g/ml，加入培養(yǎng)液稀釋至所需濃度100、200、400 μg/ml。T-47D細(xì)胞培養(yǎng)于含不同濃度(100、200、400 μg/ml)巴戟天水提取物的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別為巴戟天低、中、高劑量組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。將si-NC、si-LIFR-AS1分別轉(zhuǎn)染至T-47D細(xì)胞后加入含400 μg/ml巴戟天的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別為巴戟天高劑量+si-NC組、巴戟天高劑量+si-LIFR-AS1組。

1.3采用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR檢測(cè)LIFR-AS1表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組T-47D細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入去RNA酶(DEPC)水稀釋20倍后放入-20℃冰箱內(nèi)保存。qRT-PCR體系與反應(yīng)程序均按照熒光定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，并檢測(cè)細(xì)胞中LIFR-AS1(內(nèi)參GAPDH)相對(duì)表達(dá)量。

1.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 各組T-47D細(xì)胞接種于6孔板(1×103個(gè)/孔)后放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)14 d，使用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入甲醇(500 μl)，將其放入-20℃冰箱內(nèi)固定20 min，棄甲醇后加入1%結(jié)晶紫染色液(400 μl)，室溫孵育15 min后使用蒸餾水洗滌，晾干后觀察克隆形成數(shù)。

1.5細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 各組T-47D細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后棄上清，加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞(500 μl)，將預(yù)冷乙醇(70%)加入細(xì)胞懸液后棄上清，加入RNaseA(50 μl)，37℃水浴30 min后加入碘化丙啶(PI)染色液(450 μl)，將其放入4℃冰箱內(nèi)孵育30 min后應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及Flowjoe軟件分析各組細(xì)胞周期所占比例。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 T-47D細(xì)胞中加入預(yù)冷PBS洗滌后棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒操作并檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn) T-47D細(xì)胞接種于6孔板(1×103個(gè)/孔)，各組處理完成后在培養(yǎng)板底部的水平方向畫線作為參照，培養(yǎng)48 h后再次畫線并觀察兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率〔(劃痕寬度0 h-劃痕寬度48 h)/劃痕寬度0 h×100%〕。

1.8Western印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 提取T-47D細(xì)胞總蛋白后檢測(cè)蛋白濃度并取適量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗稀釋液(1∶1 000)與二抗稀釋液(1∶5 000)，應(yīng)用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1巴戟天對(duì)T-47D增殖及LIFR-AS1表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，巴戟天中、高劑量組LIFR-AS1表達(dá)水平明顯升高，克隆形成數(shù)明顯減少，G0-G1期細(xì)胞比例明顯升高，S期細(xì)胞比例明顯降低，且巴戟天中、高劑量組各指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而各組間G2-M期細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2巴戟天對(duì)T-47D凋亡的影響 與對(duì)照組比較，巴戟天中、高劑量組凋亡率、Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低，且巴戟天中、高劑量組各指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 巴戟天對(duì)T-47D細(xì)胞周期克隆形成、LIFR-AS1表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

圖1 巴戟天對(duì)各組T-47D凋亡的影響

1～4：對(duì)照組，巴戟天低劑量組，巴戟天中劑量組，巴戟天高劑量組圖2 巴戟天對(duì)T-47D凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.3巴戟天對(duì)T-47D遷移的影響 與對(duì)照組〔(67.16±1.39)%〕比較，巴戟天中劑量組〔(43.56±1.00)%〕、巴戟天高劑量組劃痕愈合率〔(23.87±0.72)%〕明顯降低，且巴戟天高劑量組明顯低于巴戟天中劑量組(P<0.05)。

2.4干擾LIFR-AS1對(duì)巴戟天處理的T-47D增殖的影響 與巴戟天高劑量+si-NC組比較，巴戟天高劑量+si-LIFR-AS1組克隆形成數(shù)明顯增多，G0-G1期細(xì)胞比例明顯降低，S期細(xì)胞比例升高(P<0.05)，兩組G2-M期細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 干擾LIFR-AS1對(duì)巴戟天處理的T-47D細(xì)胞周期、克隆形成、細(xì)胞凋亡及遷移的影響

2.5干擾LIFR-AS1對(duì)巴戟天處理的T-47D凋亡的影響 與巴戟天高劑量+si-NC組比較，巴戟天高劑量+si-LIFR-AS1組凋亡率明顯降低，Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見表2、圖3、圖4。

圖3 干擾LIFR-AS1對(duì)巴戟天處理的T-47D凋亡的影響

1～2，巴戟天高劑量+si-NC組，巴戟天高劑量+si-LIFR-AS1組圖4 干擾LIFR-AS1對(duì)巴戟天處理的T-47D凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.6干擾LIFR-AS1對(duì)巴戟天處理的T-47D遷移及LIFR-AS1表達(dá)的影響 與巴戟天高劑量+si-NC組比較，巴戟天高劑量+si-LIFR-AS1組劃痕愈合率明顯升高，LIFR-AS1表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見表2。

3 討 論

中草藥具有抗感染、抗腫瘤等作用，其本身具有溫和性且可有效緩解患者部分病癥，但乳腺癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，中草藥抗乳腺癌的分子機(jī)制尚未闡明〔8～10〕。巴戟天具有提高免疫力、抗氧化的作用還可有效治療骨質(zhì)疏松，但其具體作用機(jī)制尚未可知〔11,12〕。本研究結(jié)果提示，巴戟天可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯而減弱乳腺癌細(xì)胞增殖能力，巴戟天可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。

LIFR-AS1表達(dá)下調(diào)與胃癌的不良生存相關(guān)〔13〕。LIFR-AS1通過(guò)miR-942-5p/鋅指蛋白(ZNF)471軸抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移〔14〕。本研究結(jié)果提示，干擾LIFR-AS1表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)巴戟天對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的作用。

綜上，巴戟天可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯而減弱乳腺癌細(xì)胞增殖能力及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可抑制細(xì)胞遷移，其作用機(jī)制與上調(diào)LIFR-AS1的表達(dá)有關(guān)。