抗犬VEGF單克隆抗體及夾心ELISA試劑盒的制備及應用

肖 敏,趙冰冰,常宏建,任曉麗,劉 云

(東北農業大學動物醫學學院 黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030)

在獸醫臨床上,腫瘤為犬常發疾病之一。據報道[1],發病率排名前五位的腫瘤依次為乳腺腫瘤、皮膚腫瘤、肛周瘤、睪丸腫瘤、陰道腫瘤。犬作為與人類關系最密切的伴侶動物,無論從臨床癥狀,細胞和組織病理學分類以及診斷上,犬腫瘤都與人類腫瘤具有較高的相似性,犬可以作為人類腫瘤研究的完美模型[2-3]。反之,人類腫瘤的研究成果也可適當借鑒到犬腫瘤的研究領域,為犬腫瘤的治療提供新的方向和靶點[4]。

血管生成是指在現有的脈管系統中形成新的血管,是腫瘤發生發展過程中的一個重要特征[5-6]。在促進腫瘤血管生成的多種細胞因子中,血管內皮生長因子(VEGF)是最主要因子,具有促進內皮細胞分裂、增生和趨化的作用[7-8],并能增強血管通透性及促進腫瘤的生長、侵襲和轉移[9],在腫瘤的生長和轉移中是必不可少的[10]。VEGF,通常被稱為血管內皮生長因子,在大多數腫瘤中均有表達,其表達與腫瘤進展有關[11]。因此,VEGF的過度表達可作為腫瘤疾病診斷標志物之一[12]。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡 BALB/c雌性小鼠,體重18～25 g,購自黑龍江省品臣科技有限公司;BL21,購自北京全式金生物技術有限公司;EcoRI,SalI,購自寶生物工程(大連)有限公司;胎牛血清,購自浙江天杭生物科技股份有限公司;RPM1640培養基,購自GIBCO公司;卡那霉素、HAT干粉(50)、HT干粉(50)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、聚乙二醇(PEG4000)、單克隆抗體亞型鑒定試劑盒,均購自Sigma公司;兔抗犬VEGF單克隆抗體,購自上海優維寧生物科技股份有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠/兔IgG,購自北京中杉金橋生物技術有限公司;其他化學試劑均為國產分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 犬VEGF引物的設計與蛋白的表達 進入GenBank數據庫,查找犬VEGF基因序列。設計引物,基因擴增后,構建原核表達載體,誘導犬VEGF蛋白。

1.2.2 小鼠免疫 以重組表達的VEGF蛋白為抗原免疫小鼠,共3次。最后1次免疫3 d后,采血,檢測血清效價,取效價最高的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。

1.2.3 雜交瘤細胞株建立 要融合時,提前3 d對效價高的小鼠進行加強免疫,取小鼠的脾細胞,與骨髓瘤細胞融合。利用ELISA法,篩選陽性克隆。

1.2.4 單克隆抗體的大量制備 取10周齡左右小鼠腹腔注射液體石蠟。7 d后用PBS重懸陽性單克隆雜交瘤細胞株,對細胞進行計數,注入小鼠腹腔內。7～10 d后收集腹水,離心,取上清分裝,-80℃保存。采用飽和硫酸銨沉淀法純化腹水。

1.2.5 單克隆抗體的特異性檢測 采用免疫印跡技術(Western Blot)和免疫熒光共聚焦技術檢測單克隆抗體特異性。

1.2.6 ELISA檢測方法的建立 (1)單抗最佳包被濃度和多抗最佳稀釋度的確定。使用十字交叉法,對單抗和多抗進行稀釋。按照標準雙抗夾心ELISA法進行檢測,每個稀釋度作3個平行復孔,確定最佳濃度;(2)ELISA試劑盒陰陽性臨界值的確定。

用本研究制備的診斷試劑盒檢測64份陰性血清樣品,計算出血清樣品的平均OD450nm值和標準差SD,且每份陰性樣品OD值是通過3次雙抗夾心ELISA求的平均值。根據統計學分析,臨界值=樣品的平均OD值+3SD,當臨界值＞樣品的平均OD值+3SD為陽性,臨界值≦樣品的平均OD值+2SD時為陰性,當樣品的平均OD值+2SD＜臨界值≦樣品的平均OD值+3SD為可疑,需重新檢測樣品。

1.2.7 對臨床收集的犬血清樣本中的VEGF水平進行ELISA檢測分析 使用已建立的雙抗夾心ELISA方法學體系,對臨床收集的96例犬血清樣本作ELISA檢測,其中包括16份犬乳腺腫瘤,25份結石,9份子宮蓄膿,20份正常犬,26份皮膚腫塊。

2 結果

2.1 免疫后小鼠血清效價檢測結果 從圖1中可以看出,第3次免疫后小鼠血清效價在1∶64 000～1∶128 000,證明小鼠免疫成功,可以進行下一步細胞融合試驗。將此血清按1∶4 000稀釋后用作篩選試驗的陽性對照。

圖1 VEGF免疫小鼠血清效價檢測

2.2 單克隆雜交瘤細胞株的建立 融合成功后,通過間接ELISA法篩選陽性孔,陽性孔的雜交瘤細胞再經過3次亞克隆,確保每個孔中細胞均是由1個細胞分裂而來。最終所有克隆孔的陽性克隆率達100%時,將該細胞株建系,如此方法得到1株雜交瘤細胞,命名為3B4。對該雜交瘤細胞株進行凍存,以用于后續試驗。

2.3 抗體亞類鑒定及腹水產生 通過小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒進行檢測,結果顯示,雜交瘤細胞株3B4所分泌的抗體類型為Ig2a型。腹水純化后,采用間接ELISA法對其進行效價測定。結果效價為1∶6 400,證明雜交瘤細胞在小鼠腹腔中成功分泌抗體,且純化成功。

2.4 單克隆抗體的特異性檢測

2.4.1 Western Blot檢測結果 由圖2可以看出3類腫瘤細胞在蛋白為27 kD大小位置均出現相應條帶,與預期VEGF蛋白大小一致。因此初步判定純化后的腹水抗體能識別并結合此3種腫瘤細胞中的VEGF蛋白。確定了所制備單克隆抗體的特異性。

圖2 Western Blot檢測3B4所分泌抗體特異性

2.4.2 免疫熒光檢測結果 如封二彩版圖3所示,左圖為FITC檢測通道的細胞漿熒光信號,中圖為FITC檢測通道的細胞核熒光信號,右圖為上述兩圖的合成。由封二彩版圖3可知,3B4所分泌的抗體能在免疫熒光實驗中檢測到VEGF蛋白的表達,并且對于VEGF在細胞中所處的位置能起到指示作用。

2.5 ELISA檢測方法的建立

2.5.1 單抗最佳包被濃度和多抗最佳稀釋度的確定由表1我們可以得知當多抗以1∶1 400包被,單抗以1∶8 000稀釋為ELISA雙抗夾心的最佳工作濃度。

表1 單抗最佳包被濃度和多抗最佳稀釋濃度

2.5.2 ELISA試劑盒陰陽性臨界值的確定 由表2結果我們計算出：平均值為0.298,標準差為0.149,臨界值為0.745,大于0.745為陽性,小于等于0.596為陰性,大于0.596且小于等于0.745為可疑,需重新檢測樣品,其中出現了一個可疑和2個假陽性樣品,進一步驗證后發現為陰性。

2.6 對臨床收集的犬血清樣本進行ELISA檢測分析 用本研究制備的試劑盒對臨床收集的96份樣本進行驗證。結果顯示,陽性樣本14份,陰性樣本82份,而實際陽性樣本為16份。其陽性符合率為87.5%,陰性符合率為97.56%。說明本研究制備的試劑盒具有較高的符合率。

表2 ELISA試劑盒陰陽性臨界值的確定

表3 犬血清ELISA檢測分析

3 討論

血管內皮生長因子作為血管生成開關的關鍵介質,通過參與多種血管生成過程,在腫瘤血管生成中起著核心作用,包括內皮細胞的存活、增殖、遷移和高通透性[13]。VEGF對腫瘤還有其他作用,包括抑制腫瘤細胞凋亡,刺激腫瘤轉移,抑制抗腫瘤免疫反應和增加腫瘤血管的通透性,減少化療藥物對腫瘤的影響等[14]。

相關研究證實,血清VEGF在人類乳腺癌患者中呈現高表達,并且與乳腺癌的進展、轉移和預后有關,血清VEGF可為乳腺癌的早期診斷、靶向治療和預后評估提供理論依據[15]。了解在發展過程中血管內皮生長因子的調節作用也可以觀察腫瘤的血管化,因為腫瘤在發展過程中利用器官或組織特異性的VEGF監管機制是非常有可能的。腫瘤血管化、生長和轉移之間的明顯聯系導致了抗血管生成藥物的發展。VEGF作為血管生成調節因子的核心,使它成為治療的主要目標。且已經制備出抗人VEGF的單克隆抗體,此單抗在人醫臨床發揮著重要的作用。

一些研究表明,犬腫瘤分泌的VEGF能促進腫瘤細胞的存活[16-17]。犬乳腺腫瘤中,VEGF在mRNA和蛋白水平上的表達都有增加。VEGF高表達與不良的臨床結果有關,包括降低生存率,還與化療或放療缺乏反應之間也有關聯。因此臨床上乳腺腫瘤患犬VEGF水平的檢測,會對患犬的預后及治療有指導性意義。但是犬VEGF的臨床檢測需要針對犬屬VEGF的特異性抗體,目前在市面上銷售的這種抗體價格比較昂貴且只適用于實驗室檢驗,因此大量制備抗犬VEGF的單克隆抗體有應用價值,可為雙抗夾心試劑盒的制備提供材料。在本研究中,將VEGF作為診斷標志物利用夾心酶聯免疫吸附法檢測其在腫瘤患犬中的表達,可為獸醫臨床犬腫瘤的早期診斷提供良好的診斷方法。

4 結論

綜上所述,本研究成功制備了一種新的具有良好生物活性的鼠抗犬VEGF單克隆抗體3B4,該抗體能夠特異性識別VEGF蛋白,并成功的制備了以該抗體為捕獲抗體的雙抗夾心ELISA檢測試劑盒,此試劑盒具有良好的敏感性、特異性和重復性,且利用本試劑盒對臨床樣本進行驗證時,陽性符合率為87.5%,陰性符合率為97.56%,具有較高的臨床應用價值,有望應用于臨床犬早期乳腺腫瘤的診斷和篩查以及治療預后評價。