基于C602菌株的羊腸毒血癥自制滅活疫苗本動物免疫試驗

李生慶,范玉霞,李志寧,劉懷新,扎 西,李積良

(1.青海省畜牧獸醫科學院,青海 西寧 810016;2.青海省祁連縣野牛溝鄉獸醫站,青海 祁連 810400)

產氣莢膜梭菌能夠產生多種外毒素,目前已發現的外毒素達 12種,其中 α、β、ε、ι為主要致死性毒素也是分型毒素,根據這4種毒素,產氣莢膜梭菌分為A～E 5個亞型[1],其中D型產氣莢膜梭菌嚴重危害養羊業,其引起的疾病為羊腸毒血癥,該病潛伏期短、發病快、死亡快[2]。

青海地處青藏高原,是我國重要的牧區之一,綿羊養殖業在青海牧區養殖業中所占比重較大,鑒于產氣莢膜梭菌的致病特點,該菌對青海省養羊業構成一定程度的威脅。據青海省海北州祁連縣2007-2010年綿羊發病死亡情況調查,平均3.9%的發病死亡率中,該病的致死率達到1.7%,接近綿羊發病死亡的50%,戶均死亡達到3.6只,經濟損失在1 500元左右。若按全縣60萬只的飼養量計算,僅該疾病死亡的經濟損失每年高達300～500萬元。

在我國,多年來曾先后研制了滅活單菌苗、多聯菌苗預防D型產氣莢膜梭菌引起的腸毒血癥,取得了一定的防控效果,但D型產氣莢膜梭菌病仍時有發生[3]。鑒于此,本實驗室在提高C602產氣莢膜梭菌菌株產毒能力的基礎上,研制了羊腸毒血癥氫氧化鋁單價疫苗,并以不同毒價、不同免疫劑量的鋁苗為試驗組、以市售四聯苗作為對照組,分別同時免疫綿羊,檢測了自制疫苗的綿羊免疫效果,根據試驗查明,困擾我省羊四聯苗免疫綿羊急性死亡的原因是由于現用疫苗免疫期較短,不能完全控制該病的發生導致的。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 本試驗所用羊只由青海省海北州祁連縣野牛溝鄉一養殖戶提供,羊群未進行四聯苗免疫,體重15～18 kg之間,體況良好。

1.2 藥品 羊腸毒血癥自制鋁苗(批號：201501、201502青海省畜牧獸醫科學院高原動物疫病診斷與防治實驗室研制);羊四聯苗,購自青海省生物制品廠。

1.3 羊只免疫 試驗共分為6組,A組：1.5萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)0.5 mL免疫組,B組：1.5萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)2 mL免疫組,C組：1.0萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)0.5 mL免疫組、D組：1.0萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)2.0 mL免疫組、E組：羊四聯苗1.0 mL免疫組、F組：空白對照組(見中插彩版圖1)。

每組按相應劑量免疫羊10只,免疫前按組別對羊只進行耳標編號,并用藍、紅兩種顏色的自噴漆分別在頭、頸、背進行標記,并在每次采集血清時補噴1次,直至試驗結束。標記后,按組別以不同劑量進行疫苗注射免疫。具體數據見表1。

表1 免疫羊組別設置

1.4 血清采集 上述免疫羊只于免疫后1、2、3、4、6、9個月按組別頸靜脈采血3～5 mL,在4℃冰箱過夜,待血清析出后,按組別吸出血清待用。

1.5 中和毒素制備 將C602菌株在自制VF培養基中厭氧培養16 h,收集菌液于離心管中,按1∶1加入含2.5 g/L胰酶的1%Na2CO3溶液,活化后離心吸取上清,用體重18～20 g小鼠靜脈注射測定毒價,待用。

1.6 中和試驗 將上述毒素抗原遞增稀釋到相應滴度,不同毒素含量分配到不同的稀釋管中1 mL,每管加入血清0.5 mL,37℃作用50 min后,每組0.3 mL分別靜脈注射小鼠2只,觀察、記錄死亡情 況(見表2)。

表2 中和試驗稀釋注射

2 結論

2.1 C602腸毒血癥自制苗相同毒力、不同免疫劑量血清效價測定結果 從試驗數據可知,不論是1.5萬MLD/mL毒價,還是1.0萬MLD/mL的自制苗,不同免疫劑量免疫羊只后,其產生的血清抗體存在明顯差異,大劑量免疫組其免疫水平明顯高于低劑量免疫組(見表3)。

2.2 C602腸毒血癥自制苗不同毒力、同一免疫劑量血清效價測定結果 從試驗數據可知,相同免疫劑量,而疫苗的抗原量不同,其免疫效果存在明顯差異。抗原量較高的疫苗免疫羊只后產生的抗體明顯高于抗原量較低的疫苗,且疫苗的保護期較長。

2.3 羊四聯苗免疫效果 本次試驗中以現用四聯苗作為對照,試驗結果表明,該疫苗的保護期為2個月。

3 討論

3.1 相同佐劑條件下,疫苗免疫效果與毒素含量呈正比,毒素含量越高,疫苗效果越好[4]。本次試驗中我們利用D型產氣莢膜梭菌菌株C602,結合本實驗室自制的產毒培養基,得到產毒為1.5萬MLD/mL毒價和1.0萬MLD/mL毒價的D型產氣莢膜梭菌培養液,并制備氫氧化鋁單價疫苗,免疫羊只后產生了良好的免疫保護效果。前者免疫羊只2 mL,免疫9個月后,其血清抗體仍可中和6 MLD的毒素。后者免疫6個月后仍可中和6 MLD的毒素,其結果與文獻報道相一致。

3.2 按照《中華人民共和國生物制品規程》[5]要求,D型產氣莢膜梭菌氫氧化鋁類毒素疫苗免疫羊只21 d后,其血清抗體能中和3 MLD毒素即為合格,本次試驗所研制的疫苗,不同劑量免疫均達到其要求。但免疫期長短在各組別之間存在明顯差異,其中1.5萬MLD/mL毒價免疫2 mL組的免疫期最長,免疫9個月血清抗體仍可中和6 MLD毒素抗原,而1.0萬MLD/mL毒價疫苗0.5 mL免疫組免疫6個月后血清抗體只能中和3個MLD毒素抗原,羊四聯苗1 mL對照免疫組,其免疫保護期僅為2個月。我們利用已知道疫苗在該地區進行羊只免疫,基本控制了該病在該地區的繼續發生,因此,經上述對比試驗發現,青海省祁連地區羊腸毒血癥的發生于先用疫苗的免疫保護期較短有直接關系。

表3 免疫綿羊血清抗體測定結果