禽源大腸桿菌的耐藥性分析及β-內酰胺類耐藥基因的檢測

余 蕊,馬文杰,高 尚,張清一,鞠輝明,楊躍飛,王彥紅

(1.揚州大學獸醫學院,江蘇 揚州 225009;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心江蘇省人獸共患病學重點實驗室,江蘇 揚州 225009)

大腸桿菌是臨床上細菌性疾病的常見病原,具有較高的發病率和死亡率,給畜牧業帶來了巨大的經濟損失。因其復雜的血清型,導致現在還沒有確切的疫苗可以對大腸桿菌病進行預防,目前主要靠抗菌藥物對該病進行控制。隨著β-內酰胺類的抗菌藥在養殖業的廣泛應用,耐藥菌株的出現頻率也在逐年增長,β-內酰胺酶的產生是細菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的主要機制[1]。根據基因型的不同,可以將 β-內酰胺酶大致分為 SHV、TEM、CTX-M、OXA和其他型5種型,其中CTX-M型根據基因序列同源性大于95%被分為5個組群,分別為CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-8群、CTX-M-9群、CTX-M-25群。CTX-M-1群有：CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-79,等;CTX-M-2 群有 CTX-M-2、CTX-M-4、CTXM-4L,等;CTX-M-9 群有 CTX-M-9、CTXM-14、CTX-M-125,等。隨著抗菌藥不斷地更新換代,CTX-M型的β-內酰胺酶的氨基酸殘基不斷發生突變,直接影響著酶對抗生素的耐藥性[3]。為了解大腸桿菌的耐藥情況及β-內酰胺酶的基因型分布現狀,我們對5月份門診送檢病科進行了大腸桿菌分離、藥敏試驗和SHV、TEM、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群基因檢測。

1 材料與方法

1.1 病例來源 采集2017年5月揚州大學動物醫院畜禽門診送檢病例,這些病例氣囊炎、心包炎、肝周炎等病變特征。

1.2 藥品與試劑 藥敏紙片,TaKaRa LA Taq酶,dNTP Mixture,10X LA PCR BufferⅡ(Mg2+plus),100 bp DNA Ladder,Super GelRed 10 000 Xin Water,10x Ladder Buffer。

1.3 細菌分離 采集的病料接種于麥康凱培養基,37℃培養24 h,挑選單個菌落接種于麥康凱培養基上純化,并進行生化鑒定。

1.4 藥敏試驗 采用紙片法分別確認50株分離菌對于復方新諾明、氯霉素、氟苯尼考、鏈霉素、新霉素、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、頭孢曲松、多西環素、左氧氟沙星、多黏菌素、妥布霉素、美洛西林、卡那霉素15種藥物的耐藥情況。

1.5 DNA模板的制備 采用煮沸法制備細菌模板,將細菌無菌放置于事先高壓滅菌的裝有超純水的指形管中,指形管放入沸水中加熱8～10 min,-20℃保存。

1.6 PCR擴增耐藥基因 根據參考文獻[3],在上海生工生物工程技術服務有限公司合成引物(表1)。DNA模板預變性95℃加熱5 min,其中94℃變性1 min,退火溫度加熱1 min,72℃延伸1 min,32次循環,最后72℃再延伸10 min。PCR產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結果。出現預期大小的擴增產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序,比較分析,判斷產物具體的基因型。

表1 PCR擴增引物

2 結果

2.1 細菌分離 2017年5月份病料在麥康凱培養基上生長呈粉紅色,并進行生化鑒定,共分離鑒定出50株大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗 50株分離菌對復方新諾明、氟苯尼考、多西環素、鏈霉素、卡那霉素的耐藥率較高,其中對復方新諾明的耐藥率高達82%,對常用藥氟苯尼考和多西環素的耐藥率分別為60%和64%,β-內酰胺類的抗生素美洛西林和頭孢曲松的耐藥率較低,分別為26%和20%。菌株的耐藥情況見表2。

表2 50株分離菌株的耐藥情況

2.3 PCR 檢測 TEM、CTX-M-1、CTX-M-2 和CTX-M-9和SHV 5種基因50株分離菌經PCR擴增后均未檢測到SHV型及CTX-M-2群基因。PCR擴增TEM型基因,出現約900 bp的條帶,與預期大小833 bp相近(見圖1),將樣品測序結果上傳GenBank,Blast所測基因。50株大腸桿菌有23株檢測到此基因。此外,PCR擴增CTX-M-1型和CTX-M-9型,出現預期大小的條帶833 bp(見圖2)和863 bp(見圖3),將樣品測序結果上傳Gen-Bank,Blast后2株細菌的CTX-M-1型陽性產物序列均為CTX-M-79,5株細菌的CTX-M-9型分別為4株CTX-M-14,1株CTX-M-125。根據檢測結果發現有3株細菌含有至少含有2種β-內酰胺類耐藥基因,其中2株含有CTX-M-79的菌株均含有TEM基因(見表3)。

圖1 TEM型基因PCR檢測結果

圖2 CTX-M-1型基因電泳結果

圖3 CTX-M-9型基因電泳結果

表3 基因檢測陽性結果

3 討論

從本試驗的結果可以看出,臨床分離出的菌株對于磺胺類藥物耐藥性相當高,其中對復方新諾明的耐藥率甚至高達82%,對β-內酰胺類抗生素—美洛西林及頭孢曲松的耐藥率也較高。耐藥菌株出現的概率如此之高,其原因有很多種,主要是食用動物的飼養中抗生素的濫用。近幾年來我國流行的β內酰胺酶耐藥基因的種類主要是SHV、TEM、CTX-M型[4]。已有的文獻中動物源性大腸桿菌SHV的檢測為37.7%[5],而在2017年蘭芳俊等研究中發現人類醫院中存在的大腸桿菌未檢測出SHV型[6],同樣,在本研究的50株禽源大腸桿菌未發現SHV型。TEM是主要流行β內酰胺酶耐藥基因,此基因在50株禽源大腸桿菌的檢測率為46%(23/50),與近幾年的研究結果相一致[5、7]。

大腸桿菌中常存在CTX-M型,并且經研究發現不同組群的CTX-M型對不同抗生素的耐藥效果存在顯著的差異[2、8-10]。而出現變化的在于具體的基因亞型,近年來中國地區流行的主要是CTXM-14、CTX-M-15 和 CTX-M-55[2、11],而在本研究中,2017年5月份從揚州及周邊地區所分離的禽源大腸桿菌未檢測CTX-M-15及CTX-M-55,主要出現的是CTX-M-14和CTX-M-79,還出現少量CTX-M-125。此外,根據CTX-M型檢測結果和蘭芳俊的研究結果相類似,均檢出CTXM-1型和CTX-M-9型,而未檢出CTX-M-2 型[6]。

抗生素耐藥性中存在的巨大時間和地域差異可能是因為在生產實踐和臨床治療中,可能是由于不同的醫生、不同時期及不同地區使用抗生素種類及劑量的差異所導致的。細菌高耐藥性的現狀提示我們,在藥物的合理使用方面還存在欠缺,在臨床用藥時,我們可以根據藥敏試驗結果,合理選擇抗生素,不可長期大量使用同一種抗生素,避免耐藥細菌特別是超級細菌的大量出現。