魚類轉基因技術研究進展

董安然 成智麗 張彤 王宏宇 柏彬彬

(大連海洋大學水產與生命學院；遼寧省水生生物重點實驗室，遼寧大連 116023)

魚類是人類重要的蛋白質來源之一，且具有懷卵量大、體外發育，易于觀察等特點。因此，魚類不但是重要的經濟動物也是研究中常用的模式動物。轉基因技術有效打破了動物細胞接納外源基因的進化壁壘，能將人為篩選改造過的基因遺傳給下一代。相比于傳統育種，為培育和改良優質高產、抗逆性強的魚類新品系提供了更高效的途徑。1985年，朱作言等研制出世界首例轉基因魚并建立了第一個轉基因魚模型，隨后英國、法國、美國等幾十個實驗室開始了轉基因魚的研究[1]。近幾年，美國批準了轉基因大西洋鮭(Salmosalar)上市，成為全球第一例準入市場的轉基因動物食品[2]。極大促進了培育安全可靠轉基因魚新品種的步伐。

1 魚類轉基因技術的主要原理及方法

1.1 魚類轉基因技術的主要原理

魚類轉基因是通過轉基因技術，人工操作把外源目的基因導入性細胞系，使外源目的基因整合到動物本身的基因組中，從而外源目的基因隨胚胎發育賦予受體動物新的生物學性狀并穩定遺傳給后代。如果外源目的基因整合到動物的部分細胞的基因組中,叫作嵌合體動物；而動物所有的細胞均整合外源目的基因,并具有將外源基因遺傳給下一代的能力,叫作轉基因動物。可以說，魚類轉基因技術是分子生物學、細胞學、遺傳學、胚胎學、發育生物學等學科的綜合應用[3]。

不論是原核顯微注射法等物理手段，或者DEAE-葡聚糖法等化學手段，還是逆轉錄病毒介導的生物手段，其目的是將外源目的基因導入性細胞系，重點在于外源目的基因的整合與表達效率。通過對生物基因與表現型進行分析,從而了解外源目的基因的功能。

1.2 修飾外源目的基因常用方法

1.2.1 鋅指核酸酶技術

ZFN ( zinc finger endonuclease )，鋅指核酸酶是第一代人工核酸內切酶。鋅指核酸酶包括DNA切割結構域FokI和鋅指結構的DNA識別結構域兩部分。FokI內切酶只有形成二聚體才有活性，DNA識別域包含3個或更多的Cys2-His2鋅指蛋白。這些鋅指蛋白每個可與3個連續的堿基對相互作用。ZFN技術開啟了基因組靶向修飾技術的大門，與同源重組相比大大提高了基因編輯效率，其缺點在于細胞毒性和脫靶現象，且成本相對昂貴，所以被TALEN取代。

1.2.2 類轉錄激活因子效應物核酸酶技術

TALEN( transcription activator-like effector nuclease)，類轉錄激活因子效應物核酸酶是第二代人工核酸內切酶，包括人工改造的核酸內切酶切割域FokI以及DNA識別域。DNA的識別區域包含許多重復保守的氨基酸序列模塊組，其中每34個氨基酸組成一個模塊，第12位、第13位氨基酸種類可變，決定了模塊識別靶向點的特異性。TALEN與ZFN相似的是都是由一個結合域、DNA序列識別區以及一個DNA切割域構成的，不同的是TALEN的兩個單體尾對尾對靶DNA進行特異性識別、結合，具有切割活性的非特異性二聚體FokI實現識別和切割。相比于ZFN，TALEN具有使基因操作簡便、低毒性、低脫靶率等優點。但制約TALEN應用推廣的因素在于其模塊組裝費時費力。

1.2.3 CRISPR/CAS核酸酶技術

CRISPR/CAS 9系統，成簇規律間隔短回文重復序列/成簇規律間隔短回文重復序列關聯蛋白是第三代人工內切酶技術，CRISPR系統有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三種類型，CRISPR/CAS 9是由結構較為簡單的Ⅱ型系統為基礎衍生而來。其原理簡述為crRNA-tracrRNA形成RNA雙鏈導向RNA分子(sgRNA)，sgRNA與CAS 9蛋白結合，進而實現對靶DNA的編輯。其較前兩代的優勢在于成本低、制作簡單、效率高、適用性廣。

基因編輯技術在轉基因魚類的研究中，主要應用在基因敲除、基因定點整合和基因轉錄調控三方面。對于培育新品系，實現多基因調控性狀的改良，基因編輯技術具有廣闊的前景和重要意義。近年來，利用基因編輯技術在斑馬魚的研究中，進行基因敲除實驗和轉基因實驗。日本學者(2014年)運用CRISPR/CAS 9技術，對evx2 基因位點和eng1b 基因位點進行修飾，用顯微注射法注射到斑馬魚性細胞系中，成功將外源目的基因整合并表達；劉斐斐(2017年)等利用CRISPR/CAS 9技術有效將外源目的基因整合到斑馬魚基因組的特定位置，通過顯微注射法將eGFP熒光蛋白導入斑馬魚性細胞系中，獲得了51.72%的轉基因斑馬魚。

1.3 魚類轉基因技術的常用方法

1.3.1 顯微注射法

顯微注射法是借助顯微鏡的放大技術，直接將外源目的基因注射到魚類卵母細胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干細胞活體細胞中，然后生產個體的方法。此方法是制備轉基因生物最簡單可靠的方法，其應用范圍廣，轉基因長度可達數百kb，即盡量在合子(受精卵)形成早期導入轉基因的DNA，當精子和卵細胞結合，DNA就被直接注射入細胞中，不需要載體。因此，不存在擾亂該過程的外源基因序列。其缺點在于導入的基因隨機整合在染色體DNA上，有時會導致轉基因動物基因組的重排、易位、缺失或點突變。顯微注射法應用依賴于魚類卵母細胞體外成熟技術，至今報道的卵母細胞能在體外條件下完全成熟的只有金魚、斑馬魚和青鳉3種[3]。在斑馬魚、大西洋鮭魚、鯉魚、美國鲇魚、泥鰍魚、鯽魚等轉基因研究中廣泛采用此方法。1986年，Ozato等用顯微注射法將外源目的基因SV40PcCr導入青鳉魚體內成功獲得了轉基因魚[4]。

1.3.2 電穿孔法

電穿孔法是利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，在細胞膜上形成納米大小微孔，使外源目的基因轉移到細胞中。此方法可大批處理受精卵且操作簡便，但外源基因導入隨機且轉移頻率相對較低[3]。1992年，Buono等用此技術成功使乙酰轉移酶基因在斑馬魚體內表達[5]。

1.3.3 精子載體介導法

該方法是將精子作為外源目的基因運載工具，用人工授精的方法導入卵內的技術。其優點是準確性極高，且省略了顯微注射等方法的復雜過程和設備；缺點在于難以高效地將外源目的基因導入精子細胞中。目前，根據外源目的基因的導入形式等，又可分為直接混合法、電穿孔精子載體法、脂質體法三種。1989年，沈孝宙用鯉精子作為運載工具，成功獲得超過50%明顯表達生長素的轉基因魚[6]。

1.3.4 基因槍法(微彈轟入法)

基因槍法是用吸附DNA的鎢微粒子高速轟擊受體細胞，從而達到轉移外源目的基因的目的。此方法在植物轉基因領域應用較多。其優點在于可在短期內處理多個細胞。但由于其穩定性和表達的問題，以及魚類的卵核小而卵黃大的特點，導致該方法應用較少[3]。1990年，Zelenin等用基因槍法將含有半乳糖酶和新霉素磷酸轉移酶的目的基因序列成功轉移到虹鱒、歐洲泥鰍和斑馬魚的胚胎中[7]。

此外，動物轉基因技術還有染色體片段微注入法、逆轉錄病毒介導法、胚胎干細胞介導法、磷酸鈣共沉淀法、激光處理法、DEAE-葡聚糖法等。但在魚類轉基因研究中，還沒有較為成功的報道。

2 魚類轉基因技術的研究方向

2.1 抗病育種

轉基因動物研究中，抗病育種一直作為一個研究熱點，在魚類轉基因的研究中對比畜牧轉基因抗病育種工作，開展的工作相對晚一些。2004年，Mao等使用電穿孔法將hLF基因的cDNA轉入草魚的性細胞系中，獲得了超過55%的對嗜水氣單胞菌抗性顯著提高的轉基因草魚；2005年，EL-Zaeem and Assem將鯊魚的DNA注射到了羅非魚性細胞系中，獲得了具有抗體活性高、免疫球蛋白大量提高的轉基因魚類。

2.2 性狀改良

魚類的品種改良涉及到魚的生長速度、適應性、營養組成和抗逆性等。對比傳統育種通過轉基因技術對魚類進行品種改良可以極大縮短改良進程。在最早的轉基因魚類的研究中，首先是導入生長激素基因(GH)加快生長速度，提高經濟效益。2000年，Martinez等成功從鮭魚提取生長激素，導入了羅非魚性細胞系中，在CMV啟動子驅動下，成功培育出食物轉化率顯著提高2.9倍的轉基因魚。在品種改良中，抗凍蛋白的轉基因魚類培育也是轉基因的熱點，但此前的轉抗凍蛋白基因魚類都未達到預期效果。2005年，Dunham等將轉抗凍蛋白的斑點叉尾鮰置入土池，存活率對比非轉基因斑點叉尾鮰約提高40%。通過轉基因技術對魚類進行品種改良育種，將是未來的重要研究方向。

2.3 模式生物

魚類具有個體適中，世代周期短、胚胎透明、體外發育等特點，斑馬魚是魚類中較有代表性的種類。因此，轉基因魚類作為模式生物對于基因的表達調控、形態發生發育、環境監測藥物篩選等領域具有獨特優勢。2009年，夏銘等成功用轉基因斑馬魚構建了胰島素β-細胞發育模型；2013年，蒲韻竹等用轉基因斑馬魚建立了阿爾茨海默病動物模型[10]。隨著多種魚類基因組測序工作的完成，我們看到了魚類作為模式生物的廣闊前景，為人類在疾病治療、疾病機理、藥物研發等領域提供了更多科學依據。

3 魚類轉基因技術的發展趨勢

3.1 轉基因技術與多種生物技術結合發展

近幾年，轉基因魚類的研究主要集中在提高生長速度、抗逆抗病育種等與經濟效益有關的研究工作，但隨著分子生物學、生物信息學等相關領域的不斷突破，魚類轉基因研究將越來越呈現多學科交叉的特點。最近，我國我國完成了大量魚類的基因組測序和功能基因注釋工作，包括鯉魚、草魚、大黃魚等，將已知魚類的優良性狀通過轉基因平臺，可以廣泛的開展轉基因魚類的育種工作?；蚓庉嫾夹g的發展不僅顯著提高了轉基因效率，還在外源目的基因的定點整合中，對轉基因魚類的研究起到了不可替代的作用。未來的魚類轉基因，將會越來越依靠分子生物學、細胞學、遺傳學、胚胎學、發育生物學等學科等學科的理論技術突破，完成自身的創新發展。

3.2 重要功能基因來源多樣化

隨著基因組、蛋白組等“組學”的發展，以及基因組測序、高通量基因篩選、基因組關聯分析等技術的大規模應用，外源目的基因的來源呈現多樣化趨勢，可以從微生物、動物、植物等挖掘出抗旱、抗寒、抗蟲、營養改良等功能豐富的基因。魚類作為脊椎動物門中占半數以上的種類，其繁殖周期和繁殖數量的優勢明顯，將會成為功能基因的“重要產地”和性狀輸出生物，為轉基因育種研究注入新的動力。

3.3 多基因復合性狀轉基因魚的研發

轉基因魚類在研發初期主要集中在單一功能的外源目的基因上。隨著生物技術的不斷進步，多基因復合性狀的轉基因技術將成為研發重點。多基因不僅能夠使性狀協同表達，還會大大提高基因轉化率。未來轉基因魚將具有肉質好、生長快、耐低溫低氧等許多復合優良性狀。

3.4 轉基因魚類作為生物反應器的研發

生物反應器是指通過轉基因生物對外源目的基因的高效率表達，進而工業化生產功能蛋白質的技術?，F在，世界許多公司利用轉基因生物反應器生產醫用蛋白，例如β-乳球蛋白、hFVIII和紅細胞生成素等。但以轉基因魚類作為生物反應器的研究還相對滯后，魚類作為高產量、低成本的生物反應器優勢明顯。隨著魚類轉基因技術的日趨成熟，魚類作為生物反應器必將迎來屬于自己的時代。