油棕葉片冷凍切片技術研究

張大鵬 馮美利 秦海棠 王永 曹紅星

摘? 要? 為了便于研究油棕葉片的解剖結構，獲得高質量的冷凍切片，對油棕葉片冷凍切片關鍵參數進行研究，優化了快速觀測油棕葉片解剖結構的冷凍切片方法。結果表明：以油棕嫩葉為實驗材料，初切成2 mm×2 mm規格;冷凍包埋塊為5 mm×5 mm，在-30℃冷凍速凍臺上，設置冷凍箱-20℃，標本頭-10℃，可切出厚度5 μm以上的冷凍切片，切片效果好。該方法可用于研究油棕葉片解剖結構的切片制作和顯微觀測，在油棕種質資源鑒定與評價方面有著廣泛的應用價值。

關鍵詞? 油棕 ;葉片 ;冷凍切片

中圖分類號? S565.9? ? 文獻標識碼? A? ? Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.11.016

Frozen Section of Oil Palm Frond

ZHANG Dapeng? FENG Meili? QIN Haitang? WANG Yong? CAO Hongxing

（Coconut Research Institute， CATAS， Wenchang， Hainan 571339）

Abstract? In order to obtain high quality frozen section of oil palm frond to study the frond anatomical structure， the key factors related to frozen section of oil palm frond were analyzed and the frozen section of oil palm frond for quick observation of the frond anatomical structure was optimized. The results showed that the tender oil palm frond of oil palm as experimental material was cut into sections 2 mm×2 mm and embedded 5 mm×5 mm for freezing. In the? -30℃ quick-freezing table， the freezer was set at the temperature of -20℃ and the sample head was -10℃. Under this condition the frozen sections of the oil palm frond were sectioned 5 μm thick or more， with better sectioning effect. This frozen sectioning method could be used for section preparation for microscopic observation of anatomical structure of oil palm frond， and had an wide application value in identification and evaluation of oil palm germplasm resources.

Keywords? oil palm ; frond ; frozen section

油棕（Elaeis guineensis Jacq.）作為世界上產油量最高的木本油料植物之一，具有廣闊的開發利用前景[1]。然而，中國油棕產業起步較晚，大多從國外引進，缺乏自主知識產權的品種[2]。引進品種需經長時間引種試種觀察，才能確定能否在生產上應用。因此，有必要對油棕種質資源進行鑒定評價，擇優利用。葉片解剖結構作為鑒定種質資源的重要依據之一[3-6]，其快速獲取切片的方法有利于提高油棕種質資源的評價效率，在鑒定評價油棕種質方面有重要的應用價值。

石蠟切片作為植物切片的主要技術，因前處理時間長、操作繁瑣等缺點[7]，不利于油棕種質資源進行大批量快速鑒定，而冷凍切片技術正好彌補了這些缺點[8]。但目前該技術的研究大多用于醫療診斷動物組織[9-12]。雖有少量植物組織冷凍切片的報道[13-15]，因不同種類的植物組織有不同特性，不同冷凍切片平臺所用的內部冷凍箱和樣品頭等結構也有差異，實驗結果雖有借鑒意義，但不能完全應用于油棕組織切片研究。因此，選擇適合油棕葉片組織冷凍切片方法、流程及設置冷凍切片機中冷凍箱、樣品頭的溫度參數尤為重要。

本研究以油棕葉片為實驗材料，使用冷凍切片技術，研究快速獲取油棕葉片冷凍切片的合適方法，探討了快速獲取油棕葉片組織冷凍切片的流程及冷凍切片機冷凍箱和樣品頭溫度參數。用于油棕葉片解剖結構的分析，油棕種質資源鑒定與評價方面具有廣泛的應用價值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以中國熱帶農業科學院椰子研究所油棕種質圃2年齡油棕苗嫩葉為切片材料，包埋劑采用美國櫻花公司OCT冷凍包埋劑;冷凍切片機及顯微鏡型號分別為Leica CM 1900、Leica DM 2500;分析純甘油封片。

1.2? 方法

1.2.1? 冷凍箱及標本頭溫度參數優化

冷凍切片機有3部分可以調節溫度，分別為冷凍箱（0～-35℃）、速凍臺（0～-45℃）、標本頭（0～-50℃）。

基于前期分析，冷凍箱、速凍臺和標本頭的優化方案為：速凍臺溫度設為定量即-30℃，以便快速固定試壓材料;冷凍箱、標本頭設為變量，即-5、-10、-20℃，用于篩選最優溫度。

1.2.2? 切片厚度的對比

預制包埋盒規格為5 mm×5 mm×5 mm，將待測葉片切成2 mm×2 mm規格，將初切葉片置于已加入OCT包埋劑的包埋盒中，放置在冷凍切片機內速凍臺上完成固定包埋。根據優化結果設置冷凍切片機參數，樣品頭上初修包埋塊大小，將待切面修整為以葉片材料為中心的3 mm×3 mm規格。取5、20、40、60 μm厚度的切片，比較觀片效果。

1.2.3? 切片后滴加甘油的不同處理設計

用載玻片粘取切片，在加蓋玻片的階段滴加甘油封片，比較立即滴加、遲加、不加甘油3處理的觀片效果，確定最佳的甘油處理。

2? 結果與分析

2.1? 冷凍切片機速凍臺、標本頭溫度參數的優化及切片后效果

由表1可知。在不同溫度下，冷凍包埋劑隨著溫度的下降硬度增強，較高（-5℃）和較低溫度（-20℃）時，冷凍切片厚度均難控制。其中，冷凍箱和標本頭均為-5℃時，包埋塊較軟;均為-20℃時，包埋塊較硬，均不利于控制油棕葉片冷凍切片厚度。而標本頭為-10℃、冷凍箱為-20℃條件下，可以切得厚度5 μm的切片。

高等植物中，細胞的直徑通常為10～100 μm[16]。研究發現，油棕葉片表皮、柵欄和海綿組織細胞的近似直徑分別約為10、25、15 μm。由此可知，厚度5 μm的切片可獲得單層細胞結構，便于油棕葉片解剖結構的觀察和分析。

由圖1可知，經過染色處理的石蠟切片葉肉細胞較清晰，視野有分層感，獲取切片的時間長;冷凍切片獲取快速，視野清晰無分層感，具有良好的觀測效果，可根據需要進行染色、制作永久切片。

2.2? 不同厚度切片的對比

由圖2可知，切片清晰程度隨切片厚度的增加逐漸降低，5 μm切片（A）的解剖結構清晰可見;20 μm厚度切片（B）視野模糊，難以用于分析葉片的解剖結構;40、60 μm厚度切片（C、D）已無法用于觀測。

2.3? 滴加甘油的不同處理結果

由圖3可知，立即滴加甘油加蓋玻片（A）可以獲得視野清晰、葉片結構完整的冷凍切片，有助于油棕葉片解剖結構的研究與分析;延遲滴加甘油（B）不利于蓋玻片加蓋，易產生氣泡進而影響觀測、分析和葉片解剖結構圖片的獲取;不滴加甘油（C）則會導致切片失水，葉片解剖結構被破壞，進而顯微觀測失真，不利于葉片組織內部柵欄組織、海綿組織的觀測與分析。

3? 討論與結論

冷凍切片技術多用于人體或其他動物器官的醫學研究[17-18]，應用于植物組織方面不多[19]。本研究所得到的參數雖可獲得較好的油棕葉片切片，但仍屬于初級研究階段，與石蠟切片技術相比，還可在染色、烘干、永久切片等方面進行后續研究。因組織物理特性不同，要獲得油棕的根、莖、葉、花、胚等其它組織的冷凍切片，應分別研究。本研究相關結果可作為研究其它植物葉片冷凍切片的初始操作參考，再進行優化以獲得最適步驟和參數。本研究表明：以油棕鮮葉為試驗材料，在冷凍速凍臺設定為-30℃;冷凍箱為-20℃;標本頭為-10℃條件下，可切出5 μm以上厚度的冷凍切片。該方法彌補其它切片技術所存在的組織前處理時間長、繁瑣等問題，也可進行染色及永久切片處理，其獲得的切片清晰完整，有利于快速分析油棕葉片解剖結構，對培育或篩選適合我國栽培的油棕種質資源具有重要的意義。

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