4,7-二甲基香豆素的合成及潛在靶標

劉潤藝，薛禮運，周 化，劉曉玲，梁曉東

(1.深圳萬樂藥業有限公司,廣東深圳518029；2.億帆醫藥股份有限公司,安徽合肥230000)

香豆素又名苯并吡喃酮，具有抗菌、抗凝、抗腫瘤、抗癌及消炎等生理活性和光學活性，常用于食品、化妝品、醫藥、染料及光學等領域，用途廣泛。4,7-二甲基香豆素是一種重要的香料和醫藥中間體，一般由間甲酚與乙酰乙酸乙酯為原料進行合成[1-2]，多用硫酸、磷酸、多聚磷酸等作為溶劑兼催化劑，但這些反應體系較粘稠，不利于大規模生產，且廢酸過多，后處理較為麻煩。本實驗以間甲酚和乙酰乙酸乙酯為原料，二氯甲烷為溶劑，硫酸為催化劑，采用Pechmann縮合反應合成4,7-二甲基香豆素，用正交實驗法[3]優化4,7-二甲基香豆素的最佳合成反應條件。該方法反應條件溫和、后處理簡單便捷、反應體系均勻，適宜大批量生產，且所用硫酸量較少，對環境更為友好。為探索研究該化合物的潛在藥用價值，利用Discovery Studio進行反向模擬找靶，4,7-二甲基香豆素的潛在靶標可能為糖原合成酶激酶-3β。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

間甲酚（工業級，安徽海華科技股份有限公司），乙酰乙酸乙酯（分析級，上海潤捷化學試劑有限公司），二氯甲烷（分析級，上海潤捷化學試劑有限公司），硫酸（分析級，國藥集團化學試劑有限公司），無水硫酸鈉（分析級，上海潤捷化學試劑有限公司），無水乙醇（分析級，上海潤捷化學試劑有限公司），實驗用水為蒸餾水。

YRE-201D型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司），YRT-3熔點儀（天津市天大天發科技有限公司），BRUKERAVANCE III HD 400 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司），LC-20A島津液相色譜儀（日本島津儀器公司）。

1.2 合成路線

酚和β-酮酸（或酮酸酯）在酸性條件下反應合成香豆素類化合物的反應稱為Pechmann反應，反應機理為經酯化（或酯交換）、分子內親電取代成環、失水得到產物[4-5]，常用質子酸或路易斯酸作為催化劑[6-8]。本文采用間甲酚和乙酰乙酸乙酯作為起始原料，以二氯甲烷作為反應溶劑，硫酸作為催化劑，經Pechmann反應得到4,7-二甲基香豆素，反應方程式見圖1。

圖1 4,7-二甲基香豆素的合成Fig.1 Synthesis of 4,7-dimethylcoumarin

1.3 正交實驗設計

通過預實驗得知：硫酸用量、反應溫度和溶劑用量對反應摩爾收率可能影響較為顯著。因此，本實驗以4,7-二甲基香豆素摩爾收率為考核指標，在保持n（間甲酚）∶n（乙酰乙酸乙酯）=1∶1.1的前提下，考察硫酸與間甲酚質量比X1、反應溫度X2和溶劑比X3三個因素對反應的影響。具體方案見表1。

表1 實驗因素及水平Tab.1 Experimental factors and levels

1.4 實驗方法

在裝有溫度計、干燥管和攪拌子的250 mL三口燒瓶中加入6.3 g（0.058 mol）間甲酚、8.3 g（0.064 mol）乙酰乙酸乙酯和31.5 mL二氯甲烷，攪拌均勻。在5℃（低于反應溫度約5℃）下緩慢滴加12.45 g的硫酸，0.5 h滴畢。滴畢后在10℃下保溫反應8 h。反應完畢后，緩慢地向反應液中滴入60 mL水，充分攪拌，分出二氯甲烷層。水層以二氯甲烷提取兩次（30 mL×2）。合并二氯甲烷層，分別以60 mL水、60 mL飽和碳酸氫鈉溶液、60 mL水洗滌，加入無水硫酸鈉干燥2 h，過濾，濾液40℃下濃縮至干，得粗品，所得粗品以2倍體積的無水乙醇重結晶，得白色針狀結晶。

4,7-二甲基香豆素，熔點132℃（文獻值130～132 ℃[1]）。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.48(d,J=8.0 Hz,1H,ArH),7.13(s,1H,ArH),7.10(d,J=8.0 Hz,1H,ArH),6.22(s,1H,CH),2.45(s,3H,CH3),2.42(s,3H,--CH3)。HPLC圖譜見圖2，純度99.95%，HPLC歸一化法：色譜柱為島津C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相為50 mmol醋酸銨緩沖液（以三氟乙酸調節pH至4.0）與乙腈的體積比為35∶65；流速1 mL/min；檢測波長215 nm；柱溫35℃。

圖2 4,7-二甲基香豆素HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of 4,7-dimethylcoumarin

2 結果與討論

2.1 實驗結果

正交實驗結果見表2。

表3為正交實驗結果分析。表3中K值（Ki為任意列上水平號為i時所對應的試驗結果之和）為各因素水平對指標的總影響，R值（各列中最大K值與最小K值之差）為極差，表明各水平因素對指標的敏感度，極差越大，所對應的因素越重要。由表2可以得知，硫酸用量影響最大，反應溫度次之，溶劑用量影響最小。由正交實驗得出的最佳反應條件為：硫酸與間甲酚質量比為2.5；反應溫度為20℃，二氯甲烷與間甲酚體積質量比為15 mL/g，此時，4,7-二甲基香豆素的摩爾收率可達63.9%。

表2 正交實驗結果Tab.2_ Orthogonal experimental results

2.2 反應條件對合成的影響

2.2.1 硫酸用量

在此反應中，硫酸既是催化劑也是吸水劑。Pechmann反應有一分子水生成，硫酸的吸水作用能有效地促使反應向正向進行。硫酸用量過少，反應不能完全進行，摩爾收率較低。從表2可以看出硫酸的最合適用量應為間甲酚質量的2.5倍，如果再增加硫酸，摩爾收率反而下降，可能是因為間甲酚在過量硫酸中發生了磺化反應。因此，硫酸用量應控制在2.5倍左右。

表3 正交實驗結果分析Tab.3 Analysis of orthogonal experimental results

2.2.2 反應溫度

實驗結果表明，在10℃下反應時，摩爾收率較低，可能是反應速率過慢而導致間甲酚未能完全轉化。當溫度升至30℃時，摩爾收率略微下降，可能是產物在較高溫度下發生磺化導致。因此，反應溫度應控制在20℃左右。

2.2.3 溶劑用量

從表2結果可以看出，溶劑對摩爾收率影響很小。二氯甲烷量增加時，摩爾收率略有增加，但增量很小。理論上二氯甲烷作為提取溶劑，量越多時提取效果越好，正交實驗結果也顯示二氯甲烷與間甲酚體積質量比為15 mL/g時摩爾收率最高。從成本考慮，在實際生產中選用二氯甲烷與間甲酚體積質量比為10 mL/g。

3 潛在藥物作用靶標探測

糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，以α和β兩種亞型存在，參與多種細胞功能[9]。其主要作用是糖原合成酶（GS）的磷酸化，因此GSK-3參與了2型糖尿病的發生[10]。此外，抑制GSK-3可能有助于治療神經退行性疾病，如阿爾茨海默病[11]和神經疾病，如雙相情感障礙[12]。由于GSK-3抑制劑具有很高的治療價值，尋找和發現GSK-3抑制劑具有很高的實際意義。

3.1 小分子的處理與準備

將Chem Draw繪制的二維結構導入DS（Discovery Studio 2018 Client）窗口中。采用Prepare Ligand工具，將小分子轉化為三維結構，再用Full Minimization進行能量最小化處理，此處理會對訓練集小分子加氫和賦予CHARMm力場。

3.2 反向找靶

將處理好的分子作為反向找靶的配體，用DS中的Ligand Profiler功能進行反向找靶。在PharmaDB pharmacophores中勾選Shape，添加形狀束縛的搜索限制。在Input PharmaDB pharmacophores中Model Selection設置為Most Selective，其中Most Selective便是只搜索每個蛋白的第一個藥效團模型，最后點擊運行。

3.3 找靶結果

計算機找靶發現5千多個靶標，根據FitValue值，確定靶標的可靠程度，選擇打分值較高的前20個靶標（表4），表中具有ShapeSimilarity值的靶標說明4,7-二甲基香豆素與共晶復合物中的配體具有一定的形狀相似性，且值越高相似程度越大。綜合分析，PDB數據庫（Protein Data Bank，蛋白質數據庫）中，ID號為3zrl（蛋白質數據庫中一種蛋白質）可能為4,7-二甲基香豆素的潛在靶標，此靶標為糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）。

表4 反向找靶結果Tab.4_ Results of reverse targeting

3.4 分子對接

用篩選得到的靶標（PDB：3zrl）進行分子對接，探究4,7-二甲基香豆素與糖原合成酶激酶-3β的分子-蛋白相互作用。

3.5 受體配體的準備

在DS中，通過Prepare Protein進行糖原合成酶激酶-3β蛋白的預處理，給蛋白去水加氫，去除雜原子。將共晶復合物配體的結合位點定義為對接的結合位點，用來進行分子對接（圖3），球形部分為結合位點。4,7-二甲基香豆素作為配體，按照反向找靶的方式進行準備。對接過程中將共晶復合物的配體和4,7-二甲基香豆素一起進行對接。

圖3 定義的活性位點Fig.3 Defined active site

3.6 對接參數的設置

先通過共晶復合物的配體進行對接，計算RMSD（Root Mean Square Deviation，均方根偏差）值，保證對接參數的可靠性。通過對接結果得出的10個構象與原共晶中的配體對比計算得出RMSD為0.4527，說明對接參數可進行接下來的對接程序。

3.7 對接結果

分子對接能量打分值中，原共晶配體的能量值為-33.110 9，4,7-二甲基香豆素的能量值為-24.737 4（如表5）。

表5 分子對接能量值Tab.5_ Molecular docking energy value

在對接結果中發現，4,7-二甲基香豆素結構中的內酯鍵的羰基氧與受體中的賴氨酸有氫鍵相互作用，與天冬氨酸有弱的碳氫鍵相互作用。此外，4,7-二甲基香豆素結構中的苯環以及甲基與受體中的丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸都有弱的相互作用（圖4，5）。

圖4 對接結果2D圖Fig.4 2D graph of docking result

圖5 對接結果3D圖Fig.5 3D graph of docking result

4 結 論

以間甲酚和乙酰乙酸乙酯為原料，以二氯甲烷為溶劑、硫酸為催化劑合成4,7-二甲基香豆素，工藝簡單，摩爾收率較高。經過正交實驗優化的合成條件為硫酸與間甲酚質量比為2.5；反應溫度為20℃，二氯甲烷與間甲酚體積質量比為15 mL/g，4,7-二甲基香豆素摩爾收率可達63.9%。產品HPLC純度99.95%。利用Discovery Studio進行反向模擬找靶，4,7-二甲基香豆素的潛在靶標可能為糖原合成酶激酶-3β。