PCR技術在使用亞胺培南治療的患者中檢測真菌感染的臨床意義

劉東育等

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2017.26.66

摘要 目的：探討熒光PCR技術在使用亞胺培南治療的患者中檢測真菌感染的臨床意義。方法：選擇31例使用亞胺培南治療的患者，收集治療前后的標本各2份。1份采用傳統培養法，1份采用PCR法檢測真菌。結果：兩種方法均檢測出白色念珠菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌。PCR法檢出陽性11例，陽性率35.48%；傳統培養法檢測陽性5例，陽性率16.12%。5 dPCR檢測陽性率5.2%，7 d檢出陽性率35.48%。結論：PCR檢測真菌感染的穩定性好，敏感性和特異性均較理想。

關鍵詞 抗菌藥；亞胺培南；真菌病；熒光PCR技術

隨著廣譜抗菌藥的廣泛應用，臨床條件性致病菌和耐藥菌株越來越多，特別是真菌感染日益增多，而其臨床表現缺乏特異性，易誤診、漏診，延誤最佳治療時機，或行真菌預防性治療導致過度醫療。本研究對使用亞胺培南一西司他丁鈉治療的患者應用熒光定量PCR技術檢測其血液、深部痰液中念珠菌DNA，可敏感、快速及時和準確地報告結果，為診斷患者真菌感染、使用抗真菌的時機及抗真菌藥的選擇提供臨床依據。

資料與方法

標本來源于2013年1月-2017年1月我院重癥醫學科收治需使用亞胺培南治療的患者31例，其中重癥胰腺炎7例，重癥肺炎8例，胃腸穿孔術后15例，其他1例。

傳統培養及科瑪嘉顯色鑒定：將臨床樣本接種于薩布羅培養基中進行培養，涂片鏡檢為真菌后接種至科瑪嘉假絲酵母菌顯色培養基（CHROMA-gar）中進行培養，假絲酵母菌屬類別根據菌落顏色的變化進行鑒定。白色假絲酵母菌為翠綠色，熱帶假絲酵母菌為藍灰色，克柔假絲酵母菌為粉紅色，光滑假絲酵母菌為紫色，其他假絲酵母菌為白色（如近平滑假絲酵母菌等）。薩布羅培養基購自天津市金章科技發展有限公司，科瑪嘉顯色培養基購自鄭州博賽生物技術股份有限公司。

真菌基因提取及PCR擴增：待檢標本的真菌DNA用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取，其中血液樣本先進行紅細胞裂解處理。根據假絲酵母菌IST1、ITS2及拓撲異構酶Ⅱ的序列設計的不同種類的特異性引物，引物均由生工生物工程（上海）有限公司代為合成。以提取的基因組DNA為模板，采用以下試驗體系和程序進行PCR擴增。PCR反應體系（終濃度）：1×PCR緩沖液（含MgCl₂），0.2μmol/L上、下游引物，0.2 mmol/L dNTP，DNA模板，2.5 UTaqDNA聚合酶，滅菌ddH₂O補齊至50μL。每次PCR試驗均需設置空白對照（模板DNA用ddH₂O代替）及陽性對照，整個過程需嚴格控制污染。

方法：31例患者均使用亞胺培南1.0g/次，1次/8 h，靜脈滴注治療，其余為一般對癥支持治療。收集患者亞胺培南治療前后的血液或痰液備各2份，送檢：1份傳統培養法，1份PCR法檢測真菌。于治療前、治療5 d時、治療7 d時分別送檢。其中排除治療前PCR法查真菌陽性者。

統計學方法：所有數據采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，采用X²檢驗；P<0.05為差異具有統計學意義。

結果

臨床標本的檢測結果：在31例的臨床標本中，兩種方法均檢測出白色念珠菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌，以白色念珠菌為多。PCR法檢出陽性11例，陽性率35.48%；真菌傳統培養法檢測陽性5例，陽性率16.12%。

PCR與傳統真菌培養法比較：兩種方法對念珠菌所檢出率差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

不同時間真菌檢測陽性率：在31例的標本中，5 d PCR檢測陽性率5.2%，7d檢出陽性率35.48%，以白色念珠菌為多見，見表2。

討論

抗菌藥物的使用是條件致病菌真菌繼發感染的主要原因，多見于肺部感染，主要為深部白色念珠菌感染。其中念珠菌多部位定植是重癥患者發生侵襲性真菌感染的獨立危險因素。治療期間在3～5 d即有真菌生長，以5～20 d發生率最高。而傳統的真菌培養法需用5～7 d出結果，且敏感性不高，而PCR法2 h即可完成。傳統的真菌培養法與PCR法陽性檢出率有顯著差異，充分表明了PCR法比傳統培養法靈敏。需要注意的是PCR法檢測中發生污染的可能性大，導致假陽性，對檢測結果需要綜合分析。

亞胺培南一西司他丁鈉為廣譜抗菌藥，在ICU重癥感染患者中的使用較廣泛。本品適用于多種病原體所致和需氧（厭氧）菌引起的混合感染及病原菌未確定前的早期治療。本研究以亞胺培南治療后5 d PCR法檢查真菌陽性率5.2%，7 dPCR真菌陽性率35.48%。根據PCR法檢查結果及時給予抗真菌治療，取得了較好的臨床效果。本實驗的目的是通過熒光定量PCR技術對患者疑似真菌感染進行敏感、快速、及時和準確的檢查，對患者合理使用抗真菌藥的時機及抗真菌藥物的選擇尋找依據。隨著熒光PCR標記技術的飛速發展，其特性已應用于念珠菌臨床快速的診斷、基因分型、耐藥等研究。endprint