DSG2、E-cadherin及pAkt在前列腺癌組織中的表達及相關(guān)性

李宏偉 徐 凱 付金芳 魏永鴿

(黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063)

前列腺癌早期缺乏特異性的臨床癥狀和體征，很多患者被確診時已處于中晚期，延誤了治療的最佳時機〔1〕。橋粒芯糖蛋白(DSG)是橋粒的主要跨膜蛋白，其中DSG2表達水平下降可能參與了角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，并在腫瘤的發(fā)生過程中有重要作用。有研究證實〔2〕，DSG2在表皮腫瘤中呈低水平表達。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是鈣黏附蛋白家族中重要的細(xì)胞間黏附分子，研究表明〔3〕，E-cadherin編碼基因(CDH1基因)發(fā)生突變使E-cadherin表達水平下降，繼而通過復(fù)雜的病理機制增加惡性腫瘤的易感性而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Akt又稱蛋白激酶B，是惡性腫瘤患者組織中常見的超活化激酶，對惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、侵襲等有重要調(diào)節(jié)作用，磷酸化Akt(pAkt)是Akt發(fā)揮功能的重要形式。研究顯示〔4〕，pAkt在胃癌組織中呈高表達，推測可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。本研究通過檢測DSG2、E-cadherin、pAkt在前列腺癌組織中的表達情況，旨在探討三者在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年9月至2016年9月黃河科技學(xué)院附屬醫(yī)院收治的117例經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實為前列腺癌的患者為前列腺癌組，納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未行任何放、化療治療者，排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、腎功能障礙者。年齡47～83歲，平均(69.2±8.5)歲；確診時前列腺特異性抗原(PSA)含量2.4～19.8 ng/ml，平均(8.2±3.4)ng/ml；Gleason評分分級〔5〕：高分化(2～6分)75例，中、低分化(7～10分)42例；TNM分期〔6〕：Ⅰ期29例，Ⅱ期53例，Ⅲ期30例，Ⅳ期5例；有轉(zhuǎn)移者39例，無轉(zhuǎn)移者78例。于同期選取100例良性前列腺增生患者作為良性病變組，年齡43～81歲，平均(67.5±7.4)歲；收集組織標(biāo)本時的PSA含量0.3～5.7 ng/ml，平均(1.1±0.8)ng/ml。同時隨機選取30例黃河科技學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的健康志愿者為對照組，年齡47～75歲，平均(68.3±8.7)歲；收集組織標(biāo)本時的PSA含量0～0.6 ng/ml，平均(0.2±0.1)ng/ml。研究過程取得醫(yī)院倫理委員會的同意。

1.2方法 組織標(biāo)本均以10%中性甲醛進行固定，石蠟包埋后采用組織芯片制備儀制備成為芯片；將每個組織制備成HE切片，并在顯微鏡下定位典型病變部位，并標(biāo)記相關(guān)的區(qū)域然后將其與石蠟組織標(biāo)本比較，確定標(biāo)記部位在石蠟組織的同一部位后也進行標(biāo)記；制作空白的蠟塊，大小為長36 mm×寬26 mm×高15 mm，在空白蠟塊25 mm×21 mm的范圍內(nèi)打一個1.5 mm的孔，以制作108(12×9)點陣芯片模塊；在空白蠟塊的小孔內(nèi)放入標(biāo)記好的目標(biāo)組織，每一例標(biāo)本均進行編號，在空載體芯片蠟塊中，從第1排的第3個小孔開始，按照序號依次將所有的標(biāo)本種植在空白的蠟塊中，然后通過石蠟切片機連續(xù)切片。

將制備好的組織芯片4 μm的石蠟切片在58℃下烤18 h，然后常規(guī)脫蠟并磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，然后再用檸檬酸緩沖液抗原對其進行修復(fù)，持續(xù)時間20 min后室溫下冷卻20 min，再以PBS清洗3遍，將20%的蛋清滴至石蠟切片后置于室溫下30 min；然后加入混合物(1∶50的鼠DSG2或者E-cadherin或者pAkt和1∶100的CK8/18)后在室溫環(huán)境中孵育4 h，并以PBS清洗3遍，再加混合物(1∶30的羊抗鼠IgG-FITC和1∶100的生物素羊抗兔IgG)，在室溫環(huán)境中避光孵育1 h，再以PBS清洗3遍，加入Streptavidin.Cy3后在室溫環(huán)境下孵育1 h，以PBS清洗3遍，后以蒸餾水清洗3遍，并通過防熒光碎滅劑進行封片；在LeicaTCS SP2激光掃描共聚顯微鏡下進行掃描，然后通過計算機采集數(shù)據(jù)處理后數(shù)字成像。

1.3評價方法 染色的細(xì)胞核中有紅色的熒光則計為DSG2、E-cadherin、pAkt陽性；發(fā)生免疫反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞與組織核的比值即為蛋白的表達計算方法。

2 結(jié) 果

2.1三組DSG2、E-cadherin、pAkt表達水平比較 三組研究對象的DSG2、E-cadherin、pAkt表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較，前列腺癌組、良性病變組中DSG2、E-cadherin的表達水平低于對照組、pAkt表達水平高于對照組，并且前列腺癌組中DSG2、E-cadherin的表達水平低于良性病變組、pAkt表達水平高于良性病變組(P<0.05)。見表1。

表1 三組DSG2、E-cadherin、pAkt水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與良性病變組比較：2)P<0.05

2.2DSG2、E-cadherin、pAkt表達水平與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系 PSA≥8 ng/ml的前列腺癌患者組織中DSG2、E-cadherin表達水平顯著低于PSA<8 ng/ml的患者，pAkt表達水平顯著高于PSA<8 ng/ml的患者，TNM Ⅲ～Ⅳ期的前列腺癌患者組織中的DSG2、E-cadherin表達水平顯著低于Ⅰ～Ⅱ期患者，有轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者組織中DSG2、E-cadherin表達水平顯著低于無轉(zhuǎn)移者，pAkt表達水平顯著高于無轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。見表2。

2.3DSG2、E-cadherin、pAkt之間的相關(guān)性 DSG2與E-cadherin呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.659，P<0.05)，DSG2、E-cadherin與pAkt均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.739、-0.682，P<0.05)。見圖1～圖3。

表2 DSG2、E-cadherin、pAkt表達水平與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系

圖1 DSG2與E-cadherin的相關(guān)性

圖2 DSG2與pAkt的相關(guān)性

圖3 E-cadherin與pAkt的相關(guān)性

3 討 論

PSA是臨床篩查和診斷前列腺癌、評估預(yù)后的重要腫瘤標(biāo)志物，但有報道顯示〔7〕，前列腺炎以及良性前列腺增生等均可導(dǎo)致PSA水平升高。有學(xué)者〔8〕研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)PSA≥20 ng/ml時，在良性前列腺疾病、前列腺癌患者中所占的比例分別為41.53%、58.47%?？梢?，僅采用PSA診斷前列腺癌極有可能造成誤診和漏診，從而延誤病情的治療。

DSG作為一種糖蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞間橋粒的主要成分，主要有3種基因型，DSG1在正常的表皮細(xì)胞上部表達，而DSG3則主要表達于正常的表皮細(xì)胞下部，DSG2主要表達于基底細(xì)胞層。研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，DSG2的表達發(fā)生障礙可引起橋粒的破壞，繼而參與多種表皮惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。關(guān)于DSG2在惡性腫瘤發(fā)病機制中的作用，現(xiàn)有研究主要集中在天皰瘡等表皮惡性腫瘤中〔10〕，對DSG2在其他惡性腫瘤中表達的研究報道相對較少。E-cadherin是介導(dǎo)Ca2+依賴的細(xì)胞和細(xì)胞間黏附的鈣黏蛋白家族成員，E-cadherin在上皮細(xì)胞表面廣泛表達，通過介導(dǎo)Ca2+依賴細(xì)胞黏附可維持正常上皮細(xì)胞的極性，調(diào)控細(xì)胞生長〔11〕。病理學(xué)結(jié)果顯示〔12〕，E-cadherin介導(dǎo)的Ca2+依賴細(xì)胞黏附可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等，即當(dāng)細(xì)胞之間的黏附能力增強可引起腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降，反之則使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)的病灶部位并侵襲轉(zhuǎn)移至其他部位。研究顯示〔13～15〕，E-cadherin在胃癌、乳腺癌及前列腺癌組織中的表達明顯減少，其可能介導(dǎo)了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。pAkt有三種哺乳動物Akt亞型，分為Akt1、Akt2以及Akt3，其中Akt1亞型與Akt2和Akt3的相同點約為82%，每一個亞型分別有激酶區(qū)、血小板蛋白同源區(qū)以及羧基端調(diào)節(jié)區(qū)。Akt被磷酸化后將從膜上分離，進而磷酸化細(xì)胞膜以及細(xì)胞核內(nèi)的靶目標(biāo)。有研究顯示〔16〕，Akt過度表達通過調(diào)節(jié)不同類型下游底物而促進惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、并抑制其凋亡。

本研究結(jié)果顯示，DSG2、E-cadherin表達下調(diào)，pAkt表達上調(diào)而參與前列腺癌的發(fā)生過程。此外，DSG2、E-cadherin、pAkt與PSA水平、臨床病理分期以及有無轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PSA水平越高、臨床分期越高以及前列腺癌轉(zhuǎn)移患者的DSG2、E-cadherin表達水平更低，pAkt表達水平更高。提示DSG2、E-cadherin、pAkt參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，聯(lián)合檢測DSG2、E-cadherin、pAkt可評估前列腺癌患者的病情及預(yù)后。進一步分析DSG2、E-cadherin、pAkt之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示DSG2與E-cadherin呈正相關(guān)關(guān)系，DSG2、E-cadherin與pAkt均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示DSG2、E-cadherin、pAkt通過相互作用共同參與了前列腺癌的發(fā)生過程。

綜上所述，前列腺癌患者組織中DSG2、E-cadherin表達水平上調(diào)，pAkt表達水平下調(diào)，三者相互作用共同參與了前列腺癌的發(fā)生過程，聯(lián)合檢測可評估前列腺癌的病情及預(yù)后，臨床有重要的參考價值。

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