灌服飽和甲烷水對大鼠運動能力及改善力竭運動導致肝臟氧化應激的影響

胡靜蕓 辛 磊 陳笑歡 王 茜 婁淑杰

(上海體育學院運動科學學院，上海 200438)

力竭運動會造成肝臟氧化應激損傷，引起粗面內質網擴張、斷裂及線粒體腫脹，并減少糖原的合成量〔1〕。近年來動物實驗發現，吸入2.5%的甲烷(CH4)氣體不僅能改善血液供應，還具有抗感染、抗氧化的生物學效應。而腹腔注射飽和甲烷水(0.99 mmol/L)能顯著改善大鼠小腸、肝臟等組織器官的缺血再灌注損傷〔2～6〕。但CH4在國內外運動實踐中的應用研究還未見相關報道。SD大鼠在運動前腹腔注射飽和甲烷水能提高其力竭運動中的血糖利用率，減少運動后的代謝產物堆積，同時減輕骨骼肌氧化應激損傷的程度，從而起到抗疲勞的作用，延長其運動時間〔7〕。但是注射會損傷皮膚和黏膜，而口服更便利經濟。本實驗擬探討灌服飽和甲烷水對SD大鼠運動能力和肝臟氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 8周齡健康雄性SD大鼠18只，體重160～180 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供(許可證批號：SCXK(滬)2013-0016)。按體重隨機分為安靜對照組(C組)、運動安慰劑組(EP組)和運動甲烷水組(EM組)，每組6只。大鼠分籠喂養，每籠3只，自由進食飲水。光照時間8：00～18：00，室內溫度22℃±3℃，相對濕度50%～60%。

1.2飽和甲烷水制備 參照Xin等〔8〕飽和甲烷水的制備方法，用注射器將充有2/3容積蒸餾水的醫用注射液袋內的空氣抽盡，再緩慢充滿CH4氣體(甲烷購自上海基量標準氣體有限公司)，將其置于0.4 MPa壓力下加壓5 h，使CH4氣體溶于蒸餾水中達到飽和，使用前1 d制備，4℃貯存。

1.3運動方案 參照Huang等〔9〕的大鼠力竭運動模型并加以改進。大鼠適應性飼養1 w后，EP組和EM組進行3 d適應性跑臺訓練，10 min/d，跑速10 m/min，C組不運動。休息2 d后所有大鼠禁食過夜，EP組、EM組大鼠分別在運動前30 min灌服4 ml蒸餾水和飽和甲烷水，跑臺坡度為0°，初始速度為10 m/min，10～20 min內逐漸將速度增至25 m/min，持續運動至力竭，并記錄大鼠的運動時間。C組放于跑臺旁邊，不做任何干預。運動后期，大鼠跑步較前期明顯吃力，不能堅持原跑速，由蹬地跑變為半臥位跑，腹部與跑道時有接觸。運動末期，大鼠先后滯留跑臺后1/3處達3次以上，各種刺激驅趕無效，停跑后表現為腹臥位，呼吸急促，神情倦怠，對刺激反應遲鈍，捕捉時逃避反應明顯減弱，判定為力竭。

1.4實驗取材及指標檢測 力竭運動后所有大鼠經腹腔注射10%水合氯醛(4 ml/kg體重)麻醉處死，下腔靜脈取血5 ml于促凝采血管，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min后取血清，-80℃冰箱保存待測。速取肝臟組織，用0.9%生理鹽水沖洗干凈，錫箔紙包好，迅速放入液氮中，之后移入-80℃冰箱保存。化學比色法檢測肝臟組織中的肝糖原、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平，檢測血清中血糖(GLU)、乳酸(LD)、尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)水平，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測肝臟組織中3-硝基酪氨酸(NT)和8-羥基脫氧鳥苷(OHdG)含量，試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。各指標的測定嚴格按試劑盒提供的步驟進行。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1灌服飽和甲烷水對大鼠運動總時間的影響 運動前30 min給大鼠灌服飽和甲烷水后，EM組運動至力竭總時間〔(122.50±14.20)min〕顯著長于EP組〔(88.50±9.77)min,P<0.01〕。

2.2灌服飽和甲烷水對大鼠GLU和肝糖原含量的影響 力竭運動后，EP組血清中GLU濃度〔(5.32±0.49)mmol/L〕和肝臟中肝糖原含量〔(1.36±0.49)mg/g〕均顯著低于C組〔(6.75±0.24)mmol/L,(1.95±0.39)mg/g〕，而EM組〔(6.37±0.54)mmol/L、(1.94±0.48)mg/g〕均顯著高于EP組(P<0.01,P<0.05)。

2.3灌服飽和甲烷水對大鼠血清中LD和BUN含量的影響 力竭運動后，EP組大鼠血清中LD和BUN含量〔(9.00±1.86)、(19.10±2.52)mmol/L〕均顯著高于C組〔(6.40±0.74)、(14.58±1.27)mmol/L〕，而EM組〔(5.74±0.71)、(16.25±1.06)mmol/L〕均顯著低于EP組(P<0.01,P<0.05)。

2.4灌服飽和甲烷水對大鼠血清中CK和LDH水平的影響 力竭運動后，EP組大鼠血清中CK濃度和LDH活性〔(2.17±0.39)U/ml、(4 201.76±523.63)U/K〕均顯著高于C組〔(1.19±0.38)U/ml、(2 196.49±380.04)U/K〕(P<0.01)，而EM組〔(1.80±0.32)U/ml、(3 794.74±564.46)U/K〕與EP組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5灌服飽和甲烷水對大鼠肝臟氧化應激的影響 力竭運動后，EP組3-NT、8-OHdG和MDA含量均顯著高于C組(P<0.05,P<0.01)；EM組3-NT和8-OHdG含量低于EP組，但差異無統計學意義(P>0.05)，MDA含量顯著低于EP組(P<0.05)。EP組SOD活性、GSH-PX活力低于C組，但差異無統計學意義(P>0.05)，T-AOC水平顯著低于C組(P<0.05)；EM組SOD活性、GSH-PX活力和T-AOC水平均顯著高于EP組(P<0.01)。見表1。

表1 灌服飽和甲烷水對大鼠肝臟氧化應激的影響

與C組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與EM組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

在運動實踐中，GLU、肝糖原、LD、BUN、CK、LDH等指標可以反映運動能力，指標的變化可用于評價運動后身體功能的恢復情況〔10〕。GLU是維持運動的重要能量來源，長時間運動會導致GLU濃度下降，而為了維持GLU的動態平衡，肝臟會分解肝糖原釋放葡萄糖入血〔11〕。本研究結果表明，力竭運動會使肝糖原儲量明顯減少，GLU濃度下降，從而引起糖供能水平下降，這可能是導致大鼠運動能力下降的重要原因之一。另外運動前灌服飽和甲烷水在大鼠力竭運動后能促進GLU和肝糖原的及時恢復，這可能是CH4改善了大鼠的血液供應，并提高了肝臟的糖異生水平，使非糖物質快速合成葡萄糖。

血液中LD是運動過程中糖酵解反應的代謝物，其濃度隨運動強度的增大而上升〔12〕。LD濃度上升，會導致肌肉中H+濃度升高，pH下降，從而影響糖酵解、磷酸果糖激酶活性及Ca2+的釋放，最終影響肌肉收縮。BUN是蛋白質代謝的主要終末產物，它是評定運動后功能狀態的敏感指標，能反映運動后體內蛋白質的代謝情況〔13〕。本研究中EP組大鼠血清中LD水平顯著升高，這可能是一次性力竭運動過程中糖酵解產生的LD不能及時得到清除造成的。長時間劇烈運動會導致肌糖原含量和GLU濃度下降，并引起蛋白質分解代謝加強，生成大量的BUN并在體內堆積。而EM組大鼠血清中LD、BUN水平顯著低于EP組，這可能是因為CH4會加速血液循環，提高肝臟清除代謝產物的效率。此外，血清中CK水平在運動實踐中是評價肌肉損傷、肌萎縮的重要生化指標〔24〕。正常狀態下，CK主要存在于骨骼肌內，血清中活性很低。力竭運動會使機體產生大量的活性氧(ROS)和其他自由基，引起脂質過氧化反應，損傷肌細胞，造成肌細胞膜通透性改變，使得肌肉中的CK大量進入血液，引起血清中CK活性迅速升高〔10〕。此外，血清中LDH也是反映大強度運動后肌肉損傷的重要標志〔14〕。本研究結果表明，力竭運動引起了EP組和EM組大鼠骨骼肌受損，而EM組骨骼肌的損傷程度較輕。同時本研究還發現，EM組大鼠血清中的CK、LDH水平和肝臟中的3-NT、8-OHdG含量與EP組相比并沒有顯著性變化，這可能是4 ml的飽和CH4水灌服劑量不足或運動前灌服CH4水后的消化吸收時間較短等原因造成的。

大強度運動會導致體內氧化與抗氧化系統失衡，引起氧化應激，并對組織造成損傷。本研究結果表明，力竭運動引起了肝臟氧化應激。在運動前給大鼠灌服飽和甲烷水能提高大鼠肝臟抗氧化能力，調節肝臟氧化與抗氧化平衡，從而減輕力竭運動造成的肝臟氧化應激的程度，延長運動持續時間。本研究的結果提示，飽和甲烷水采用灌服的方式也能發揮較好的抗氧化作用，能促進力竭運動后身體功能的快速恢復，具有較大的潛在應用價值。

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