骨髓間質(zhì)干細(xì)胞靜脈注射移植對(duì)大鼠脊髓損傷后NGF及TNF-α表達(dá)的影響

陳榮生 王長(zhǎng)昇 許衛(wèi)紅

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，福建 福州 350005)

脊髓損傷(SCI)是指脊髓由于各種外力作用下(車禍、墜落傷、火器傷等)造成的脊髓某一處受損，導(dǎo)致相應(yīng)的感覺與運(yùn)動(dòng)平面神經(jīng)功能障礙，是一種嚴(yán)重的致殘性損傷，往往造成不同程度的癱瘓〔1,2〕。SCI的治療主要包括藥物治療、外科手術(shù)及后期的康復(fù)訓(xùn)練，由于損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)比較困難。因此，SCI再生修復(fù)技術(shù)一直是骨科及神經(jīng)科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來，隨著細(xì)胞移植及神經(jīng)組織工程等技術(shù)的發(fā)展，利用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植治療SCI，為SCI的治療開辟了一條新途徑〔1～3〕。大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)具有自我復(fù)制和多向分化潛能等特點(diǎn)，選擇大鼠作為SCI的模式動(dòng)物，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)，rMSCs移植治療SCI取得了較為顯著的療效〔2，3〕，但其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在探討MSCs移植治療SCI的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與材料 RNA提取所用Trizol(Invitrogen，美國(guó))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，瑞士)，PCR所用酶購(gòu)自Takara(日本)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2～3月齡清潔級(jí)雄性健康SD大鼠90只，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重170～280 g。其中制作SCI模型84只，隨機(jī)分為對(duì)照組和 rMSCs移植組各42只，剩下6只作為假手術(shù)組。

1.3rMSCs的制備 將5只SD大鼠麻醉，消毒，取四肢骨，暴露骨髓腔，用 10 ml含肝素的培養(yǎng)液沖洗骨髓腔至試管內(nèi)，加入Ficoll-Paque分離液，梯度離心，吸取富含粒細(xì)胞層，PBS洗滌2次。加入含20%胎牛血清(FBS)的AMEM培養(yǎng)液，移液器吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2的條件中無菌培養(yǎng)。

1.4SCI動(dòng)物模型建立與處理 采用改良Allen重物打擊法制作SCI模型〔4〕：首先將大鼠麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，背部備毛，暴露T10棘突。準(zhǔn)備打擊裝置整合于立體定位儀上，墊片置于暴露的T10脊髓表面，打擊裝置自由落下打擊該墊片，造成脊髓沖擊傷。在撞擊脊髓的瞬間，大鼠雙下肢迅速?gòu)梽?dòng)，身體抖動(dòng)，打擊部位呈瘀紫色，術(shù)后雙下肢完全癱瘓，表明造模成功。假手術(shù)組僅暴露脊髓，而不進(jìn)行脊髓沖擊傷。對(duì)照組靜脈注射PBS 1.0 ml，假手術(shù)組、rMSCs移植組靜脈注射1.0 ml含1×106個(gè)rMSCs的單細(xì)胞懸液。

1.5RNA提取和RT-PCR實(shí)驗(yàn) 于損傷后1、6、12、24、72、168、336 h，對(duì)照組和rMSCs移植組(n=6)取樣，提取RNA。所有接觸RNA的試劑、槍頭、塑料容器、玻璃器皿均經(jīng)0.1% DEPC水處理后，高壓蒸汽滅菌。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。取1.0 μg RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)特異性PCR引物，對(duì)NGF及TNF-α進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列分別為：NGF正義：5′-AGCCTCCTCTGCTCTTTCTGCTGGA-3′，反義：5′-CTTT′GTCTATGCCCCTGCAGCCTT-3′。TNF-α正義：5′-CGAGTGACAAGCCTGTA-3′，反義：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。β-actin正義：5′-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′，反義：5′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′。PCR程序設(shè)置如下：95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s；共35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(Bio-rad，美國(guó))后凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國(guó))掃描圖象并分條帶析灰度值。根據(jù)得到的灰度值，進(jìn)行灰度分析，目的基因的灰度值與內(nèi)參基因灰度值的比值即為該目的基因相對(duì)表達(dá)量，以(NGF/β-actin)%或(TNF-α/β-actin)%表示。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NGF mRNA的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析 以各組逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用NGF特異性引物或內(nèi)參β-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：β-actin出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的特異性擴(kuò)增帶(607 bp)，NGF擴(kuò)增后也出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的特異性擴(kuò)增帶(467 bp)，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。

2.2NGF在各組處理前后的表達(dá)水平 假手術(shù)組中NGF相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為(0.417±0.114)，對(duì)照組和rMSCs移植組NGF在損傷后1 h表達(dá)即顯著升高，且rMSCs移植組較對(duì)照組升高更明顯(P<0.05)；對(duì)照組和rMSCs移植組均于損傷后72 h升至高峰，隨后開始下降，對(duì)照組下降趨勢(shì)更為明顯，至損傷后336 h兩組NGF表達(dá)水平仍明顯高于假手術(shù)組水平(P<0.05)； rMSCs移植組各時(shí)間點(diǎn)的NGF表達(dá)水平均顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組NGF相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05；與前一時(shí)間點(diǎn)比較：3)P<0.05;下表同

2.3TNF-α mRNA的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析 以各組逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用TNF-α特異性引物或內(nèi)參β-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：β-actin出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的特異性擴(kuò)增帶(607 bp)，TNF-α擴(kuò)增后也出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的特異性擴(kuò)增帶(363 bp)，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。

2.4TNF-α在各組處理前后的表達(dá)水平變化 假手術(shù)組TNF-α相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為(0.067±0.103)，對(duì)照組和rMSCs移植組損傷后1 h TNF-α表達(dá)升高，于損傷后6 h升至高峰，之后呈下降趨勢(shì)，rMSCs移植組下降趨勢(shì)更為明顯(P<0.05)；對(duì)照組損傷后336 h基本恢復(fù)至假手術(shù)組水平，rMSCs移植組損傷后168 h即恢復(fù)至假手術(shù)組水平； rMSCs移植組損傷后6、12、24、72、168 h時(shí)間點(diǎn)的TNF-α表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平

3 討 論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病中具有神經(jīng)再生、修復(fù)功能，引起眾多研究者的興趣〔5〕。MSCs具有自我更新和多向分化等特點(diǎn)，具有很多其他來源的細(xì)胞所不具備的優(yōu)勢(shì)，如：無免疫活性，取材相對(duì)方便、可從患者自身骨髓取材，可進(jìn)行基因改造等〔6〕。因此，MSCs是移植治療的理想細(xì)胞來源，利用MSCs移植治療SCI，為SCI的治療開辟了一條新途徑。

SCI是一種比較嚴(yán)重的神經(jīng)創(chuàng)傷，研究發(fā)現(xiàn)NGF在SCI恢復(fù)過程中發(fā)揮重要作用〔7,8〕。NGF是一種分布于動(dòng)物體內(nèi)的多肽類物質(zhì)，能夠?qū)p傷神經(jīng)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)修復(fù)及促進(jìn)再生〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，NGF在正常大鼠脊髓僅輕微表達(dá)，SCI后NGF表達(dá)明顯增加。可以推測(cè)，SCI后NGF表達(dá)增加，是神經(jīng)元自我保護(hù)作用的一種反應(yīng)，但是這種自我保護(hù)、修復(fù)能力隨時(shí)間延長(zhǎng)而減弱；而rMSCs移植組可以繼續(xù)維持高水平的NGF表達(dá)，從而支持神經(jīng)元的修復(fù)、再生。NGF mRNA于損傷后1 h即開始升高，提示NGF可能在SCI的早期發(fā)揮SCI修復(fù)的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在急性SCI后炎癥反應(yīng)的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用〔10〕。炎癥因子TNF-α作為其他炎性因子的啟動(dòng)因子，可以促進(jìn)其他炎性因子的產(chǎn)生，參與損傷區(qū)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TNF-α 在促進(jìn)脊髓繼發(fā)性損傷中也起著重要作用。神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡是SCI二次損傷的關(guān)鍵因素，凋亡幾乎發(fā)生于脊髓所有類型細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可能參與該過程〔11〕。 本研究與前期其他人的結(jié)果一致，如Zhu等〔12〕研究也發(fā)現(xiàn)，TNF-α mRNA在SCI后1 h SCI區(qū)的表達(dá)就明顯上調(diào)。本研究表明，TNF-α是SCI后引發(fā)一系列不良反應(yīng)的重要因素，降低TNF-α將有助于減輕SCI的癥狀。rMSCs移植組的TNF-α表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，可見rMSCs 移植有利于降低損傷脊髓TNF-α表達(dá)，從而減輕損傷局部的炎癥程度，有助于損傷區(qū)域神經(jīng)功能的恢復(fù)〔13〕。

綜上所述，本研究通過對(duì)SCI的大鼠進(jìn)行MSCs移植后，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)NGF、TNF-α的mRNA表達(dá)水平，初步探討了rMSCs移植治療SCI的作用機(jī)制，即：rMSCs移植可通過維持NGF的持續(xù)高表達(dá)，同時(shí)抑制炎性因子TNF-α的表達(dá)，從而修復(fù)受損神經(jīng)，并盡量減輕SCI炎癥反應(yīng)和繼發(fā)損傷，為SCI的治療帶來新的曙光。rMSCs移植治療SCI的工作仍需要后續(xù)更多深入的研究。

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