大豆肽膠囊的安全性毒理學評價

楊曉，王畋，2，劉暢，黃瑩

（1.武漢躍萊健康產業有限公司研究院，湖北武漢430090；2.中國保健協會，北京100142）

大豆作為我國的糧食經濟作物，種植面積極為廣泛，大豆中的大豆蛋白能夠補充人體所需蛋白質，而且價格便宜，容易獲取，但大豆蛋白具有一定的豆腥味，而且加熱不容易凝固，遇酸會出現沉淀，不易溶于水等問題，將大豆蛋白進行深加工得到大豆肽能夠明顯改善這些問題[1]。大豆肽是一種比大豆蛋白更具有營養價值的植物蛋白，由大豆蛋白通過酶解法[2]或者微生物發酵法[3]得到，主要成分為3個～6個氨基酸組成的肽，且相對分子質量在300～700范圍內[4]。研究表明大豆肽具有優良的生物活性[5－7]，解酒[8]、降血脂[9]、提高免疫力[10-12]、抗氧化[13-15]、降低膽固醇[16]、促進脂肪代謝[17]、促進鈣和微量元素的吸收[18-19]以及抗疲勞[20-21]等。

牛磺酸是一種含硫的β-氨基酸，作為人體的一種條件必須氨基酸，以游離氨基酸的形式普遍存在于機體組織細胞內，對機體的運動能力及抗疲勞都有一定的作用[22]。黃精始載于《名醫別錄》，別名為“仙人余糧”、“救命草”、“老虎姜”等，為合科黃精屬多年生草本植物，有黃精、多花黃精和滇黃精等，在抗菌、解壓抗疲勞、抗衰老和治療心血管疾病、結核病、慢性肝炎等方面均有較好作用[23]。瑪咖含有豐富的蛋白質、碳水化合物、脂肪酸、纖維、維生素和礦物質，具有較高的營養價值，有“南美人參”之譽[24-25]，此外，瑪咖含有瑪咖酰胺、瑪咖烯、生物堿、芥子油苷、甾醇和類固醇等主要次生代謝物，具有抗疲勞、增強免疫力、提高生育力、抗炎癥、抗癌、抗氧化、抗病毒、降血壓、緩解抑郁和治療女性更年期綜合征等多種作用[26-27]。枸杞屬于茄科落葉灌木，其果實長1 cm~2 cm，為明亮的橙紅色橢球漿果，具有抗衰老，保護神經，抗骨髓抑制，提高睡眠質量等生理作用[28]。

大豆肽膠囊以大豆肽為主要原料，并加以牛磺酸、黃精、瑪咖、枸杞制成。試驗證明這些物質以一定的比例配伍能夠顯著提高機體的抗疲勞能力，但配伍后得到大豆肽膠囊的安全毒理性有待進一步研究，本文通過急性毒理學試驗、骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、鼠傷寒沙門菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）、30天喂養試驗共5項食品安全性毒理學試驗，研究大豆肽膠囊的安全性，為大豆肽膠囊開發成為保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

大豆肽膠囊由武漢躍萊健康產業有限公司提供。

1.2 試驗對象

SPF級昆明種小鼠：上海杰思捷實驗動物有限責任公司。實驗動物生產許可證號：SCXK（瀘）2013-0006；實驗動物使用許可證號：SYXK（瀘）2013-0008。根據試驗所需選用相應體重和性別的小鼠。小鼠飼料由上海福貝寵物用品有限公司提供，登記證號：滬飼證（2014）04002。

1.3 主要儀器與藥品

ACS-3A型電子天平：上海奕泰機電設備有限公司；JH5101型電子天平：上海天平儀器技術有限公司；ME403E型電子天平：深圳市力達信儀器有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養箱：上海知楚儀器有限公司；貝克曼AU680全自動生化分析儀：北京新邦天地醫療器械有限公司；希森美康XT-2000i血液分析儀：上海愷梵實業有限公司；ACS-3型電子稱：上海大和衡器常廠；HM340E切片機、STP120脫水機、HM340E包埋機、Varistain Gemini染色機：華俊醫療器械有限公司；Nikon eclipse80i顯微鏡：上海衡浩儀器有限公司；血液分析儀和試劑：希森美康醫用電子（上海）有限公司。

環磷酰胺：上海卓因生物醫學技術有限公司；TA97、TA98、TA100、TA102：美國分子毒理有限公司；對硝基喹啉、甲基甲烷磺酸、2-氨基芴、1.8-二羥基蒽醌、S-9混合液：上海皓鴻生物醫藥技術有限公司。

1.4 試驗方法

參照《保健食品檢驗與評價技術規范（2003年版）》毒理學檢驗方法進行[29]。分別進行如下試驗：急性毒性試驗[最大耐受量（Maximum Tolerance Dose：MTD）試驗方法]，小鼠畸形試驗，骨髓細胞微核試驗（Giemsa染色法），鼠傷寒沙門菌/哺乳動物微粒體酶試驗（Ames試驗）（平板摻入法），小鼠30天喂養試驗。

1.5 數據處理

用SPPS21.0軟件進行統計分析，先對數據進行正態性和方差性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發現差異再用Dunnett法進行多個劑量組與一個對照組均數間的兩兩比較。若方差不齊則進行適當的變量轉換，仍不齊則改用秩和檢驗進行統計，若總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Dunnett T3檢驗進行兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 急性經口毒性試驗

大豆肽膠囊對雌雄性小鼠急性經口毒性試驗結果見表1。

表1 大豆肽膠囊對雌雄性小鼠急性經口毒性試驗結果Table 1 Acute oral toxicity test of soybean peptide capsules on male and female mice

試驗期間各組小鼠飲食活動正常，生長良好，毛色光澤度好，未見任何中毒癥狀；試驗結束后解剖小鼠，大體觀察主要臟器均未見明顯異常，由表1可知，雌雄性小鼠死亡數量和死亡率為0只和0%，大豆肽膠囊對雌雄性小鼠急性經口毒性試驗的LD50均大于20 g/kg·BW，屬無毒級。

2.2 骨髓細胞微核試驗

小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發生率見表2。

表2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發生率Table 2 Micronucleus rate of polychromatic erythrocytes in bone marrow of mice

由表2可知，受試樣品各劑量組PCE/NCE、微核率與陰性對照組比較差異不顯著（P＞0.05），陽性對照組的微核率與陰性對照組比較差異極顯著（P＜0.01），故受試樣品的小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結果為陰性；且各劑量組PCE占RBC總數的比例不小于對照組的20%，表明樣品對小鼠骨髓細胞無抑制作用。

2.3 精子畸形試驗

動物精子畸形發生率見表3。

表3 動物精子畸形發生率Table 3 Sperm abnormality test in mice

由表3可知，受試樣品的各劑量組小鼠精子畸形率為0.78%、0.74%和0.70%，陰性對照組為0.72%，陽性對照組為5.44%。受試樣品的各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較差異不顯著（P＞0.05），陽性對照組精子畸形率與陰性對照組比較差異極顯著 （P＜0.01）。由此可知，受試樣品對小鼠精子畸形試驗結果為陰性。

2.4 Ames試驗

Ames試驗見表4、表5。

由表4、5可以看出，受試樣品的各劑量組和陰性對照組中空白對照組、溶劑對照組在加與不加S9活化系統的平板摻入法檢測的回復菌落數均小于溶劑對照的2倍，而其他陽性對照組均超過自然回變菌落數的2倍以上。所以受試樣品的Ames試驗結果為陰性，即表明受試樣品在試驗劑量 8 μg/皿～5 000 μg/皿范圍內未出現誘變作用。

表4 Ames試驗第一次試驗結果Table 4 Results of first test in Ames

續表4 Ames試驗第一次試驗結果Continue table 4 Results of first test in Ames

表5 Ames試驗第二次試驗結果Table 5 Results of second test in Ames

2.5 30天喂養試驗

2.5.1 大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率

大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率見表6、表7。

由表6、表7可見，受試樣品各劑量組大鼠的體重、攝食量、增重及食物利用率與對照組相比，差異均不顯著（P＞0.05），這表明受試樣品在該試驗條件下對大鼠的體重、攝食量、增重、食物利用率均無明顯影響，各試驗組的大鼠生長情況基本良好。

表6 雄性大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率結果（X±SD，n=10）Table 6 Results of weight，weight gain，food intake and food utilization rates in male rats（X±SD，n=10）

續表6 雄性大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率結果（X±SD，n=10）Continue table 6 Results of weight，weight gain，food intake and food utilization rates in male rats（X±SD，n=10）

表7 雌性大鼠體重、攝食量、食物利用率結果（X±SD，n=10）表 7 Results of body weight，weight gain，food intake and food utilization rates in female rats（X±SD，n=10）

2.5.2 大鼠臟器絕對重量、臟體比值

大鼠臟器絕對重量、臟體比值見表8、表9。

表8 大鼠臟器絕對重量（X±SD，n=10）Table 8 Absolute weight of organs in each group（X±SD，n=10）

表9 大鼠臟體比值（X±SD，n=10）Table 9 Ratio of organ to body weight in each group（X±SD，n=10）

由表8、表9可見，樣品各劑量組大鼠肝、腎、脾、睪丸的絕對重量和臟體比與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05），說明受試樣品在本試驗條件下對動物的臟器重量和臟體比均無明顯影響。

2.5.3 大鼠血液學檢查結果

大鼠血液學檢查結果見表10、表11。

表10 大鼠血常規測定結果（X±SD，n=10）Table 10 Blood routine test result in rats（X±SD，n=10）

表11 大鼠血常規測定結果（X±SD，n=10）Table 11 Blood routine test result in rats（X±SD，n=10）

由表10、表11可見，各劑量組大鼠的血紅蛋白、紅細胞、白細胞計數及其分類與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05），說明受試樣品在該試驗條件下對大鼠的血常規指標無明顯影響。

2.5.3 大鼠生化學檢查結果

大鼠生化指標測定結果見表12、表13。

表12 大鼠生化指標測定結果（X±SD，n=10）Table 12 Results of biochemical indexes in rats（X±SD，n=10）

表13 大鼠生化指標的影響（X±SD，n=10）Table 13 Results of biochemical indexes in rats（X±SD，n=10）

由表12、表13可見，與對照組相比，各劑量組雌雄大鼠的生化指標檢測值與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。說明受試樣品在該試驗條件下對大鼠的生化指標檢測值無明顯影響。

2.5.3 大鼠病理學檢查結果

大鼠喂養30天后，進行大體解剖，肉眼觀察各組大鼠的臟器變化，未發現明顯病變，選擇高劑量及對照組大鼠，通過顯微鏡觀察進行組織病理學檢查。檢查結果如下：

肝臟：高劑量和對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊；肝細胞大小一致，細胞核大小均一，核膜、核仁清楚，細胞質染色均勻。

腎臟：高劑量和對照組雄鼠分別有1例腎臟囊腫，其余大鼠腎皮、髓質界限清楚，腎單位結構正常，腎小球無炎性改變、纖維化、玻璃樣病變等，腎小管亦未見明顯病變。

脾臟：對照組雌鼠有1例紅髓輕度擴張。其余動物紅、白髓清楚，中央動脈位居脾小體中央，小體無明顯萎縮，脾竇擴張，脾小梁正常。

胃、十二指腸：高劑量和對照組大鼠腸胃表面粘膜正常，無炎性改變和糜爛、潰瘍形成。粘膜下、肌層、漿膜層均無炎性改變。

卵巢：高劑量和對照組大鼠卵巢內可見不同發育階段的卵泡及排卵后形成的黃體、白體。

睪丸：高劑量和對照組大鼠精細胞發育正常。

由以上檢查結果可知，本次試驗未見由該受試樣品引起的肝、腎、脾、胃、卵巢、睪丸等臟器引起的毒性病理改變。

3 結論

本實驗從急性毒性試驗、遺傳毒性試驗（Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗）和30天喂養試驗對大豆肽膠囊的安全性毒理學進行了研究，大豆肽膠囊對雌雄性小鼠急性經口毒性試驗的LD50均大于20 g/kg·BW，根據急性毒性分級標準規定，屬無毒級；遺傳毒性試驗（Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗）結果均為陰性；30天喂養試驗表明，以1.25、2.5、5 g/kg劑量的受試樣品對大鼠進行30天喂養試驗，結果表明各組大鼠生長發育良好，大鼠體重、增重、攝食量、食物利用率、臟器重量、臟體比、血液學指標、生化學指標與對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05），大體解剖和組織病理學檢查，臟器未見毒性病理改變。因此可以判定大豆肽膠囊具有較好的食用安全性，為其開發成為保健食品提供理論依據。

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