乳酸菌粘附特性的研究新進展

佘銀，羅芳，高婉茹，李鑫，劉霞

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410000）

乳酸菌具有改善腸道菌群結構、增強機體免疫力和緩解乳糖不耐癥等重要生理功效，可以防治肥胖、“三高”、糖尿病和精神方面等疾病[1-2]。隨著人年齡的增長和當人體處于非健康狀態時，腸道中乳酸菌的數量都會逐漸減少。乳酸菌在人體胃腸道的粘附數量及其活性是影響人體健康的重要因素之一。因此，增加人體腸道內乳酸菌的數量就顯得非常重要，而乳酸菌對胃腸粘膜的粘附作用是其定植及增生的首要條件[3]。明確益生菌的粘附機理對于制備益生菌制劑和更好地認識微生態學基本規律都有十分重要的意義。目前，隨著探究乳酸菌粘附的新方法一直涌現，學者們對乳酸菌粘附素以及腸道粘液層相關受體有了進一步的深入了解。同時發現，乳酸菌的粘附過程也受到諸多要素的影響，如生長階段、pH值、酶、氯化鋰等。本文總結了關于乳酸菌粘附特性的研究方法、粘附機理和及其影響因素3個方面的研究現狀，并對它們之后的研究前景做了一定的展望分析。

1 乳酸菌粘附特性的研究方法

評價乳酸菌粘附能力的研究方法有直接法和間接法。直接法即采用平板、染色等方法對直接粘附在腸上皮細胞或粘液上的乳酸菌計數；間接法即先利用抗體、放射性同位素、熒光素等物質標記乳酸菌，后再與細胞或腸粘液共育，從而計算該菌的粘附率。目前，一些新的實驗技術，如表面等離子體共振研究技術、計算機分子模擬法等被應用到分析乳酸菌粘附作用的研究當中，幫助研究者們進一步明確乳酸菌的粘附機理。

1.1 平板法、染色法、分光光度法

平板法是研究乳酸菌粘附作用的最原始方法，粘附在腸上皮細胞或腸粘液上的乳酸菌被釋放之后，進行平板計數，直接得到粘附的乳酸菌數量。此方法簡單，但重現性較差[4]；染色法即革蘭氏染色之后，通過計數一定細胞上的乳酸菌數可得到單個細胞被粘附的乳酸菌數量。此法較簡單，但是工作量也大，且存在一定的系統誤差[5]。分光光度法是通過粘附前后吸光值的變化來評價乳酸菌的粘附能力。此法對試驗設備的要求較低，但需要乳酸菌數量足夠多，粘附能力較強，否則會影響其靈敏度，并且無法區分活菌與死菌[6]。

1.2 放射性同位素標記技術

放射性同位素標記法指將15N、3H、35S、32P、18O等放射性元素作為追蹤劑，對研究對象進行標記的分析方法。Gueimonde等[7]將乳酸菌接入含有一定放射性的液體培養基中，培養、離心、沖洗，再用緩沖液制成菌液。之后添加到已經固定有腸上皮細胞或腸粘液的培養板內，培育、沖洗，通過其放射性評價乳酸菌粘附能力。此方法對設備要求高，且試驗過程要接觸放射性物質，對人體有害。

1.3 熒光標記技術

熒光標記法指將熒光素以共價結合或物理吸附的方式連接到研究對象的目的基團上，然后通過其熒光特性來反應被研究對象的某些信息。Das等[8]用羧基熒光素琥珀酰基胺酯（cFDA-SE）標記菌株，已標記的菌株與HT-29 MTX細胞共育后用無菌PBS緩沖液沖洗未粘附的菌株，在熒光顯微鏡下觀察得到嗜酸乳桿菌NCFM的粘附能力較植物乳桿菌WCFS1、短乳桿菌ATCC367和發酵乳桿菌BR11更強。也可以測定粘附前后熒光物質的發光強度來評價乳酸菌對細胞的粘附能力。該法操作較復雜，對試驗設備要求較高，乳酸菌的表面性質會受到影響。此外，隨著時間的延長，熒光物質的發光性能會慢慢減弱，所以在實際應用中也較少。

1.4 顯微鏡研究技術

透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）是一種具備高分辨率的電子光學儀器。Polakberecka等[9]通過TEM可明顯觀察到鼠李糖乳桿菌E/N具有纖維狀的胞外多糖，而鼠李糖乳桿菌PEN不具有胞外多糖，并比較了兩者的粘附能力，結果表明具有胞外多糖的菌株粘附能力更強。

掃描電鏡（Scanning Electronic Microscopy，SEM）指介于透射電鏡和光學顯微鏡間的可以觀察到研究對象微觀性貌的一種觀察手段。Vesterlund等[10]首次采用了共聚焦掃描電鏡技術對腸道細菌進行了實時三維觀察，此法解決了在多種菌同時存在的情況下也同樣適用的問題。

原子力學顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）是通過原子、分子間的相互作用力來觀察物質表面的形貌，即而可得到其待測樣品的表面情況相關信息[11]。Tripathi等[12]利用AFM研究了鼠李糖乳桿菌GG與粘蛋白的相互作用，從構建三維立體的結構中直接以力的形式觀察研究物質間的作用。此法對樣品處理的要求簡單，無需導電，可在多種環境下工作。因此，AFM在乳酸菌的粘附機理研究方面有著良好的應用前景。

1.5 基于免疫學的粘附實驗技術

在對乳酸菌表面蛋白進行粘附性實驗中，Western Blot雜交技術被多次應用。Zhang B等[13]應用Western Blot技術對植物乳桿菌NL42細胞表面的細胞壁固定蛋白進行了檢測，確定了細胞壁固定蛋白在該菌的粘附作用中起到了作用。該方法可能會導致交叉感染，在實際應用中，由于高質量的單克隆抗體往往很難獲得，價格高，所以該方法的發展也受到了一定的限制。

1.6 表面等離子體共振研究技術

表面等離子體共振技術（Surface Plasmon Resonance，SPR）是從20世紀90年代發展起來的一種基于物理光學原理的新型分析系統。運用SPR技術，可以直接的觀測到菌體粘附性的情況，得到相互作用的結合常數，且對樣品的需求量小，樣品處理簡單、檢測靈敏度高。但是，目前這種方法運用的并不是很普遍，但該方法可為人們研究乳酸菌的粘附機制提供新的途徑。

Uchida等[14]第一次利用SPR技術對嗜酸乳桿菌與人體結腸粘液的粘附性進行了研究，并通過此方法篩選得到粘附能力較強的菌株。Leeuw E D等[15]利用SPR技術對短乳桿菌ATCC8287的S-層蛋白與細胞外基質蛋白的粘附性進行了研究，結果顯示SlpA與粘蛋白和層粘連蛋白具有較強的粘附能力。Nakamata K等[16]利用SPR技術對鼠李糖乳桿菌上粘蛋白與豬結腸粘液、層粘連蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白四型的粘附性進行了研究，結果表明突變型菌株的粘附能力較野生型菌株弱。

1.7 計算機分子模擬法

計算機分子模擬法是計算機在科研工作中被不斷應用而發展起來的一門新的科學研究方法，通過計算機軟件以原子水平的模型來模擬研究對象的結構和行為，從而進一步模擬物質的各種理化性質。該方法可以分析分子間結合過程的相關分子構象、靜電勢能、疏水性等物理性質，找到底物與受體的最佳結合位點和作用力類型[17]。Das等[8]利用蛋白質-蛋白質對接軟件（Hex ver 6.0）對4種乳桿菌細胞表面的粘蛋白與腸粘蛋白的三維空間結構對接情況進行了分析，篩選出了對腸粘蛋白具有最高粘附能力菌株。

2 乳酸菌的粘附機理

乳酸菌的粘附能力是評價其作為益生菌的重要標準之一[3]。粘附能力弱的乳酸菌進入人體之后會隨著腸道的蠕動不斷地被排出體外，而高粘附能力的乳酸菌在腸道可以停留較長時間，甚至在腸道內得以生存和繁殖，繼而充分發揮其功能[18]。目前，研究一致認為乳酸菌的粘附過程首先是可逆的非特異性粘附階段，之后，乳酸菌粘附進入到特異性粘附階段，該階段主要是由乳酸菌表面粘附素與腸上皮細胞或腸粘液中的粘附受體進行特異性的結合的過程。

2.1 乳酸菌的非特異性粘附階段

乳酸菌的非特異性粘附過程跟復雜的物理化學作用密切相關，大量研究表明乳酸菌的表面性質對乳酸菌的粘附具有重要作用，尤其是與其表面電荷，疏水作用，自聚合能力等具有密切聯系[19]。B.kos等[20]研究證明，自聚集能力對嗜酸乳桿菌M92與豬腸上皮細胞的粘附作用有一定的促進作用。龔虹等[21]通過研究比較產品中5株益生菌生物膜形成能力、自凝集能力和疏水能力，通過實驗發現三者呈正相關，均可作為考察菌株粘附能力的指標。然而，García-Cayuela T等[22]探討了植物乳桿菌的自聚集能力、共聚集能力和菌株表面疏水性質三者之間的相互聯系，結果表明自聚集能力強的菌株共聚集能力更強，而與疏水性和粘附能力沒有表現出一定的相關性。可見，乳酸菌的粘附能力受諸多因素的影響，其細胞表面特性與粘附之間的關系還值得我們進行深入研究。

2.2 乳酸菌的特異性粘附階段

乳酸菌進行非特異性粘附之后，進入乳酸菌粘附素與宿主腸道上皮細胞或腸粘液相應受體間的特異性粘附階段[23]。粘附素主要是乳酸菌表面一些蛋白質，多糖、脂磷壁酸等多樣化分子，圖1是乳酸菌表面分子結構示意圖。宿主胃腸道粘液層的相關蛋白和糖脂可能是粘附受體，目前對細胞外基質的研究也越來越多。表1是近年來國內外關于粘附素和粘附受體的研究結果。

圖1 乳酸菌細胞表面結構示意圖Fig.1 Cell-surface architecture of Lactobacillus

表1 乳酸菌的有關粘附素和粘附對象Table 1 Adhesins and adhesion matrix of some Lactobacillus

續表1 乳酸菌的有關粘附素和粘附對象Continue table 1 Adhesins and adhesion matrix of some Lactobacillus

2.2.1 粘附素

粘附素是細菌表面具有粘附能力的一些相關蛋白質和特殊結構的統稱，可存在于細菌的菌毛、細胞壁、外膜蛋白、莢膜等結構，其化學本質是特定的蛋白質、多肽、糖脂和糖類等具有多結構的多功能化分子[23]。粘附素的重要來源主要是乳酸菌細胞表面的脂磷壁酸、完整肽聚糖、多糖和表面蛋白等物質，這些成分可能直接或間接地參與了乳酸菌的粘附過程[11]。

2.2.1.1 表面蛋白

在乳酸菌中，表面蛋白是目前研究最多的一類粘附素。它的結構為方形或六邊形對稱，且呈單分子晶體排列，相對分子質量在40 kDa~200 kDa之間。1993年，Heinj等[24]第一次從嗜酸乳桿菌ATCC4356中提取了表層蛋白。目前，大量乳桿菌中的表面蛋白都已被進行了深入的研究探索，如短乳桿菌ATCC8287的表層蛋白 A（SlpA）[15]、瑞特乳桿菌的粘液結合蛋白（Mub）[25]和粘附促進蛋白（MapA）[26]、卷曲乳桿菌的膠原結合表層蛋白（CbsA）[27]、植物乳桿菌NL42的細胞壁固定蛋白（CwaA）[13]等。其中有的已得到其基因序列，將表面蛋白基因重組到不具備粘附的益生菌基因組中是非常值得研究的一個新思路。其中，L.acidophilus ATCC 4356、L.Acidophilus NCFM、L.crispatus JCM 5810都含有SlpA、SlpB兩個表層蛋白編碼基因[27]，并且L.Acidophilus NCFM還含有SlpX表層蛋白編碼基因[28]，L.brevis ATCC 14869含有 SlpB、SlpC、SlpD 3個編碼表層蛋白的基因，具有親緣性的菌株的表層蛋白的編碼基因序列具有相似性[29-30]。

2.2.1.2 胞外多糖

乳酸菌胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中，分泌到細胞壁外，常滲于培養基的一類糖類化合物，它們都是乳酸菌為適應環境的產物[31]。在細胞外層，乳酸菌胞外多糖和含有肽鏈取代基的多糖可以形成一種多糖外層，這種多糖外層具有粘附性，可與腸道粘液層進行接觸，進而對腸道起到粘附作用[32]。另外，多糖被腸道菌群降解后產生的丁酸鹽，可以維持腸道粘膜的完整性。Polakberecka等[9]通過TEM可明顯觀察到L.rhamnosus E/N具有纖維狀的胞外多糖，而L.Rhamnosus PEN不具有胞外多糖，并比較了兩者的粘附能力，結果表明具有胞外多糖的菌株粘附能力更強。

2.2.1.3 肽聚糖

肽聚糖（Peptidoglycan，PG）是由雙糖單位，四肽尾還有肽橋聚合而成的一類多層網狀大分子結構。目前，關于乳酸菌細胞壁中肽聚糖作為粘附素的研究非常少，而多集中在雙歧桿菌細胞壁肽聚糖方面。鄧一平等[33]研究雙歧桿菌的脂磷壁酸、完整肽聚糖、多糖對豬胃粘膜糖蛋白的粘附作用。結果表明，三者均參與了乳酸菌的粘附過程。

2.2.1.4 脂磷壁酸

脂磷壁酸（Lipoteichoic Acid，LTA）是革蘭氏陽性菌的特征性膜結合聚合物，是組成細胞壁的重要成分[34]。Weidenmaier C等[35]將構建了金黃色葡萄球磷壁酸合成缺陷型的tagO基因突變體，對大鼠的鼻腔粘膜上皮細胞進行粘附，結果發現該菌體的粘附率降低了90%。Walter J等[36]對羅伊氏乳桿菌研究發現，脂磷壁酸丙氨酸殘基的缺失，顯著影響了羅伊氏乳桿菌在小鼠胃腸道中生物膜的形成能力。以上研究表明，脂磷壁酸在細菌粘附過程中具有重要意義。

2.2.2 粘附受體

除了乳酸菌細胞表面需要有粘附素外，宿主胃腸道是否含有相應的受體，決定了乳酸菌是否能夠在宿主胃腸道內有較好的粘附和定植[23]。粘蛋白是胃腸道粘液中最常見的結構成分，其次是脂質、酶和核酸的復雜混合物。迄今為止，在人類中發現了大約20種不同的粘液編碼基因，并且在其他動物物種中也發現了一些同源muc基因，在分泌的粘蛋白中，主要有MUC2、MUC5AC、MUC5B 和 MUC6，其中 MUC2是胃腸道中最主要的粘液成分[37]。因為水的重量占了胃腸道粘液的95%，所以觀察粘液層的具體形態是很有挑戰的。Johansson F等[38]利用16rRNA探針進行原位雜交，發現細菌在外部的粘液層進行了大批繁殖，但是卻不能穿過與上皮細胞相鄰的內粘液層，而上皮細胞是由緊密相連的粘液細胞組成的。因此，內粘液層在防止病原菌接觸和入侵上皮細胞的過程中扮演著重要角色。目前，研究乳酸菌對腸上皮細胞、腸粘液和細胞外基質蛋白粘附作用的成果越來越多。其中細胞外基質蛋白研究較多的包括包括膠原蛋白，層粘連蛋白，纖連蛋白和纖維蛋白等。

3 影響乳酸菌粘附作用的因素

乳酸菌的粘附作用是其菌體細胞表面的粘附素與胃腸道粘液中的受體共同作用完成的，同時，乳酸菌的理化性質以及外部環境也會影響其粘附能力，如菌體生長階段、菌液濃度、pH值、蛋白酶、離子濃度等。為了使乳酸菌在體內發揮更好的粘附效果，創造適宜的環境更有利于乳酸菌的粘附和定植。

3.1 生長階段、菌液濃度

在乳酸菌生長的不同階段，其形態結構、活性、代謝產物等都會有一定的差異，大量研究表明，大多數乳酸菌生長到穩定期的粘附性大于其他三個時期[49-50]。一般情況下，隨著菌懸液濃度的增大，乳酸菌粘附能力也隨之增大，當達到一定濃度時，乳酸菌粘附量趨于穩定。陳軍等[49]研究了青春型雙歧桿菌0926對大鼠腸上皮細胞的粘附能力，結果顯示，該菌的粘附能力隨著菌懸液濃度的增加而明顯增加，呈現S形關系，在菌液濃度為108CFU/mL～109CFU/mL時，粘附基本趨于飽和。

3.2 pH值

陳臣[51]研究發現植物乳桿菌ST-Ⅲ在pH為7時，與Caco-2細胞的粘附能力最強。Yadav等[45]研究了pH對植物乳桿菌Lp5276、Lp91與膠原蛋白相互作用的影響，結果表明在pH為6時，植物乳桿菌Lp5276、Lp91與膠原蛋白具有較高粘附能力。針對不同種類的菌株，pH對它們粘附能力的影響是不同的。總體而言，在中性或偏酸性條件下有利于乳酸菌的粘附。

3.3 酶

Yadav等[45]研究發現植物乳桿菌（Lp9、Lp5276、Lp71、Lp72、Lp91）在胰蛋白酶、胃蛋白酶的作用下，粘附纖連蛋白、膠原蛋白的能力下降約50%。在溶菌酶的作用下，其粘附能力更是下降了65%~70%。Bo Zhang等[13]研究了在不同濃度胰蛋白酶的作用下，植物乳桿菌NL42粘附HT-29細胞的能力隨著胰蛋白酶濃度的增加而降低，當胰蛋白酶的濃度達到30 mg/mL時，其粘附能力下降了約80%。研究結果進一步說明了乳酸菌表面的蛋白類物質在乳酸菌的粘附過程中起到了重要的作用。

3.4 氯化鋰、高碘酸鈉

Polakberecka等[9]研究發現，鼠李糖乳桿菌（PEN、E/N）在LiCl的影響下，自聚集能力明顯下降。趙維俊[50]研究發現隨著LiCl濃度的提高，乳桿菌表面疏水能力隨之逐漸減弱。乳酸菌細胞表面蛋白在LiCl的作用下被破壞，說明了蛋白類物質在乳酸菌的自聚集能力、疏水性作用中起到了重要作用，而乳酸菌的疏水能力和自聚集能力又是衡量其粘附能力的重要標志。Bo Zhang等[13]研究了高碘酸鈉對植物乳桿菌NL42粘附HT-29細胞的影響，結果表明，高碘酸鈉對植物乳桿菌NL42粘附HT-29細胞的影響不顯著。高碘酸鈉具有氧化菌體細胞表面碳水化合物的作用，從側面說明碳水化合物不是影響植物乳桿菌NL4粘附能力的最關鍵成分。

4 展望

目前，盡管對乳酸菌粘附機理已經做了很多研究工作，但主要集中在乳酸菌粘附素上，對腸道粘液層受體的研究還需要進一步探索；其次，關于乳酸菌粘附素，表面蛋白的研究比較全面，在今后的研究中，對各蛋白進行全基因組測序和基因組學分析對深入了解乳酸菌粘附機制有重要意義；并且，將粘附相關蛋白基因重組到不具備粘附的益生菌基因組中是非常值得研究的一個新思路，使不具備粘附能力或粘附能力低的乳酸菌在宿主體內更好的發揮益生功能；另外，脂磷壁酸、胞外多糖和肽聚糖等粘附素是如何參與乳酸菌粘附作用，其作用機制還需更深入的研究；最后，由于乳酸菌制劑種類越來越多，激素、抗生素、各種添加劑、細菌毒素等是否會影響乳酸菌的粘附定植。嚴格控制影響乳酸菌粘附的因素，使乳酸菌在胃腸道粘液中發揮最大功效，對人體健康具有重要意義。

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