氣相色譜-串聯質譜法測定水果、蔬菜中三唑錫、三環錫和苯丁錫的殘留量

朱萌萌，黃亮，周敏，陳盧濤，俞璐萍，胡松，胡晉峰，王川丕*

1(綠城農科檢測技術有限公司，浙江 杭州，310000) 2(安徽農業大學/茶與食品科技學院/茶葉生物與利用國家重點實驗室，安徽 合肥，230036)

有機錫化合物(organotin，OT)是20世紀50年代開發的農藥，按用途可分為殺菌劑、殺蟲劑和殺螨劑等[1-2]。近年來，有機錫化合物以其高效、低毒的特性而用量逐年增加，但由于其潛在的毒性和對非目標生物的影響，越來越引起人們的重視。日本肯定列表制度于2006年規定所有食品中不得檢出三唑錫和三環錫[3]；歐盟規定三唑錫、三環錫(以三環錫總和計)在水果、蔬菜、動物產品、牛奶、雞蛋中的最大殘留限量為0.01 mg/kg、規定苯丁錫在蔬菜、谷物、動物產品、牛奶、雞蛋中的最大殘留限量為0.01 mg/kg[4]；我國《GB 2763—2014食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規定三唑錫在橙、柚、檸檬、梨水果中的最大殘留限量為0.2 mg/kg，三環錫在橙中的最大殘留限量為0.2 mg/kg、苯丁錫在黃瓜中的最大殘留限量為0.5 mg/kg。

目前國內外有機錫類農藥的檢測分析方法主要包括氣相色譜法(GC-FPD)[5]、氣相色譜質譜法GC-MS[6-7]、液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP/MS)[8]等。因有機錫化合物沸點高，不能直接用于氣相色譜法的分析，需要先將其進行衍生化反應，最常見的衍生化方法主要有采用各種格林試劑烷基化[9-13]；采用四乙基硼化鈉直接在水溶液中進行衍生化[14-18]；采用硼氫化鈉在酸性環境下將有機錫轉化為相應的氫化物[19]等。采用格林試劑進行烷基化反應，這一方法操作比較繁瑣、耗時，而且需要嚴格的無水條件、不帶活潑氫離子的非極性溶劑[20]。近年來，采用四乙基硼化鈉直接在水溶液中進行衍生的方法得到越來越多的應用。本文擬采用優化后的萃取、凈化、衍生等前處理方法結合GC-MS/MS方法，探討2種衍生化試劑用于果蔬中三唑錫、三環錫和苯丁錫3種有機錫化合物殘留量分析的差異，旨在探究一種操作簡單、檢出限低、靈敏度高的前處理及衍生化方法，用于果蔬中痕量有機錫化合物殘留量的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三環錫標準品(純度≥99.0%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；苯丁錫標準品(純度≥98.5%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；三唑錫標準品(純度≥98.5%)，上海市農藥研究所有限公司；乙基溴化鎂乙醚溶液(3.0 mol/L), 默克Sigma-Aldrich中國公司；四乙基硼化鈉(2%水溶液，取0.2 mg溶解到10.0 mL去離子水)，美國Strem公司；四氫呋喃、乙腈、丙酮、二氯甲烷(色譜純)，美國J.T.Baker公司；甲苯、HCl、H2SO4(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；試驗室所用水均為去離子水；微孔有機濾膜(0.22 μm)。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-串聯質譜儀(GC-2010 plus氣相色譜儀配TQ8040質譜儀，VF-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm))，日本Shimadzu公司；ST-16R 離心機，美國Thermo Fisher公司；BSA2202S電子天平，德國Sartorius公司；漩渦混合器，美國Henry Troemner 公司；旋轉蒸發儀，瑞士Buchi公司；Cleanert Florisi弗羅里硅土固相萃取柱(500 mg/6 mL)，天津博納艾杰爾科技有限公司；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MTN-5800氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；CHK-121臺式精密酸度計：北京昌科儀自動化科技有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

進樣口溫度：250 ℃ ；載氣：高純氦氣；碰撞氣：高純氬氣，純度≥99.999%；柱流量：1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣，1.0 min后開閥；進樣量：1 μL；定量方法：外標法；升溫程序：60 ℃保持1 min，以40 ℃/min升至170 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至290 ℃，保持4.25 min；

1.3.2 質譜條件

色譜-質譜接口溫度：280 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；檢測器電壓：0.99 kV(+0.4kV)；測定方式：MRM多重反應監測模式；定性、定量離子、碰撞能量等參數見表1。

1.4 試驗步驟

1.4.1 提取

稱取5.00 g(精確至0.01 g)蔬菜或水果樣品于50 mL離心管中，加入5.0 mL一定pH的純凈水(使用體積比為1∶1為鹽酸水溶液調節pH)浸泡0.5 h，加入10.0 mL正己烷，渦旋器振蕩1.0 min，超聲提取20 min，在5000 r/min下離心3.0 min，取上清液于雞心瓶中，殘渣再次加入正己烷10.0 mL超聲提取一次，合并提取液，于30 ℃水浴中減壓濃縮至近干，在常溫條件下，氮氣流緩緩吹干有機溶劑，待衍生。

表1 三唑錫、三環錫和苯丁錫質譜檢測參數

注：*表示定量離子。

1.4.2 衍生化

(1)向上述提取液中加入衍生化試劑3.0 mol/L的乙基溴化鎂乙醚溶液1.5 mL，蓋上瓶塞，渦旋并超聲15 min，然后在冷水浴中逐滴加入1.0 mL 0.5 mol/L的稀硫酸溶液，并不斷振蕩，靜置后取上清液，待凈化。乙基溴化鎂乙醚溶液遇水劇烈反應，并產生大量熱，此過程應小心操作，保持無水環境且稀硫酸應在冷水浴中逐滴加入。

(2)向上述提取液中加入衍生化試劑2%的四乙基硼化鈉水溶液0.5 mL，蓋上瓶塞，渦旋并超聲15 min，加入2.0 mL正己烷提取衍生后產物，渦旋后離心取上清液，待凈化。

1.4.3 凈化

先用5.0 mL正己烷預淋洗Florisil固相萃取柱，將上述待凈化液轉移至小柱上，再用10.0 mL正己烷-丙酮(體積比為99∶1)溶液進行洗脫，收集全部流出液，在常溫條件下氮氣流吹至近干，用正己烷溶解并定容至1.0 mL，供氣相色譜-串聯質譜檢測。

1.4.4 標準溶液的配制

稱取三唑錫、三環錫和苯丁錫0.010 0 g，用色譜純二氯甲烷定容至25.0 mL，分別得到約107、122、44.4 mg/L標準儲備溶液(以Sn計)；用二氯甲烷稀釋為10.0 mg/L的標準工作溶液，于0～4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜-質譜條件的優化

在電子轟擊離子源(EI)檢測模式下對三唑錫、三環錫和苯丁錫進行一級質譜分析(Q3 Scan)，三唑錫在環境中水解為三環錫[16]，故三唑錫的儀器條件優化同三環錫。在質譜圖中選擇質荷比較大，絕對強度較大的離子為前體離子；設定3～45 eV(每3 eV一個間隔)的碰撞能量，對選定的前體離子峰進行二級質譜分析(產物離子掃描)，根據二級質譜圖，選擇離子強度最大的為定量離子，離子強度次之的為定性離子。圖1為使用優化后的氣相色譜質譜條件采集三唑錫(154 μg/L)、三環錫(136 μg/L)和苯丁錫(56.4 μg/L，以Sn計)標準溶液MRM質譜圖。

圖1 三唑錫、三環錫和苯丁錫MRM色譜圖Fig.1 Chromatogram of azocyclotin、cyhexatin and fenbutatin oxide in multiple reactions monitoring mode(MRM)

2.2 衍生化試劑的選擇

2.2.1 四乙基硼化鈉配制溶液的選擇

四乙基硼化鈉價格較貴，一般用去離子水或者甲醇配制，但因化學性質不穩定，易遇酸水解和氧化，需要現配現用。盧大勝[15]等研究了四乙基硼化鈉的保存條件，發現20%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液在3個月內未發現其活性的明顯變化，2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液在15 d內未發現其活性的明顯變化。本試驗將3種有機錫化合物同時采用2%四乙基硼化鈉水溶液和2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液進行衍生，結果表明(見圖2)，三環錫、三唑錫和苯丁錫經2%四乙基硼化鈉水溶液衍生后響應值分別比2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液高20.38%、19.11%和40.44%，為提高實際樣品檢測分析的靈敏度，選擇去離子水作為配制四乙基硼化鈉衍生化試劑的溶劑。考慮到四乙基硼化鈉水溶液的穩定性，建議根據試驗樣品的數量，配制適量的溶液，現配現用，可以有效降低試驗成本，并顯著提高苯丁錫檢測分析的靈敏度。

圖2 四乙基硼化鈉溶劑對衍生化效率的影響Fig.2 Effect of sodium tetraethylborate solvents on derivatization efficiency

2.2.2 兩種衍生化試劑添加量考察

在具塞玻璃離心管中分別加入5.0 mg/L的三唑錫、三環錫和苯丁錫3種標準儲備液1.0 mL(以Sn計則濃度分別為1.54、1.36、0.564 mg/L)，分別添加2種衍生化試劑0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，在常溫條件下，氮氣流緩緩吹干有機溶劑，按照1.4.2中2種衍生化方法進行衍生，并將最終體積定容為2.0 mL上機分析。結果表明(見圖3)，隨著乙基溴化鎂乙醚溶液添加量的增加，3種有機錫化合物衍生化產物響應逐漸提高，當含量增加到1.0 mL時，衍生化產物含量呈穩定趨勢。為保證衍生化反應完全，選擇乙基溴化鎂乙醚溶液的添加體積為1.5 mL。隨著四乙基硼化鈉添加量的增加，三環錫衍生化產物響應逐步提高，在添加量為1.0 mL時最高，三唑錫和苯丁錫在添加量為0.6 mL時最高，之后隨著添加量的增加，衍生化產物響應略有降低。綜合考慮試驗成本及衍生化產物的響應，選擇四乙基硼化鈉的添加量為0.5 mL。

圖3 兩種衍生化試劑添加量對衍生化效率的影響比較Fig.3 Comparison of the effects of the additives of two kinds of derivatization reagents on the derivatization

確定衍生化試劑添加量后，比較2種衍生化試劑在最佳添加量下對相同濃度的3種有機錫化合物的衍生化效率。結果表明，三唑錫、三環錫衍生化產物響應接近，而苯丁錫經四乙基硼化鈉水溶液衍生后的響應是乙基溴化鎂乙醚溶液的1.69倍左右。試驗過程中還發現，乙基溴化鎂乙醚溶液在衍生3種有機錫化合物的過程中，若3種化合物處在二氯甲烷或丙酮溶劑環境中，將導致衍生化產物的響應近乎一個數量級的降低，而四乙基硼化鈉衍生化試劑在衍生過程中則無此現象，在有無溶劑的環境下，衍生條件溫和，衍生化產物響應差異不明顯。可能由于乙基溴化鎂乙醚溶液在進行衍生反應時，需要在嚴格的無水與不帶活潑氫離子的非極性溶劑中進行，同時乙基溴化鎂乙醚溶液在冰水浴中逐滴加入時會釋放大量熱，也不可避免的造成苯丁錫衍生物三(2-甲基-2-苯基丙基)乙基錫的損失，從而導致衍生化效率的降低。而四乙基硼化鈉是在水介質和緩沖溶液中均可使用的高效化的衍生化試劑，對衍生條件要求較低且穩定，可同時對3種有機錫化合物進行衍生反應，用途較乙基溴化鎂廣泛。

2.3 提取條件的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇

有機錫化合物多為固體或油狀液體，不溶或難溶于水，易溶于有機溶劑。常用的提取溶劑有正己烷、戊烷、乙腈、二氯甲烷、甲苯等。本試驗考察了正己烷、二氯甲烷和乙腈3種提取溶劑對三環錫、三唑錫和苯丁錫提取效果的影響。試驗表明，使用正己烷和二氯甲烷提取3種有機錫化合物的回收率在79.4%～85.2%，采用乙腈提取3種有機錫化合物的回收率在50.2%～64.3%。考慮到二氯甲烷毒性較正己烷要大，且二氯甲烷提取基質中的色素較多，不利于下一步凈化過程，綜合考慮，選擇正己烷作為提取溶劑。

2.3.2 提取環境pH值的考察

3種有機錫化合物在不同酸性條件下的提取效率差別較大，KUMAR[20]等發現了一種較廣泛的提取方法是將樣品酸化后，用甲苯提取有機錫，方法回收率可達到90%。本試驗以正己烷為提取溶劑，2%四乙基硼化鈉水溶液為衍生化試劑，比較了不同pH條件下的提取效率。稱取5.0 g大白菜樣品，添加5.0 mL去離子水和5.0 mg/L的三唑錫、三環錫和苯丁錫3種標準儲備液1.0 mL，通過向樣品中添加鹽酸水溶液(體積比為1∶1)，調節樣品溶液pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，通過提取和衍生，比較不同pH條件下的提取效率。結果表明(見圖4)，3種有機錫化合物受不同pH萃取溶液環境影響較大，隨著pH的增大，提取效率逐漸降低。三環錫在pH為4.0的萃取溶液環境中提取效果最好，三唑錫和苯丁錫在pH為3.0的萃取溶液環境中提取效果最好。綜合考慮，選擇pH為4.0的萃取溶液環境。

圖4 pH值對萃取效果的影響Fig.4 Effect of the pH value on extraction efficiency

2.4 基質效應的考察

基質效應(ME)指樣品中除分析物以外的其它成分對待測物測定值的影響，即基質對分析方法準確測定分析物的能力的干擾。

(1)

式中：Pm為基質加標峰面積；Ps為純溶劑標準溶液峰面積。

本試驗前處理過程用到大量有機試劑、酸和衍生化試劑，可能對目標物的響應產生一定的影響，按照STAHNKE[21]中的添加法定量評價基質效應強度，分別測定空白提取液與純溶劑中添加相同濃度分析物的離子響應強度，考察了在添加1.00 mg/kg(以Sn計)條件下，不同基質條件對3種有機錫化合物響應的影響，結果見圖5。

圖5 不同基質對三唑錫、三環錫和苯丁錫的基質效應影響(n=3)Fig.5 Effect of different matrices on matrix effects of azocyclotin、cyhexatin and fenbutatin oxide (n=3)

苯丁錫在白菜和茄子樣品中存在微弱的基質抑制效應，3種有機錫化合物在其它基質中均存在基質增強效應，這與已知的氣相色譜分析中大多數農藥表現出不同程度的基質增強效應論點相吻合。不同基質中，三唑錫的基質增強效應比三環錫和苯丁錫強，而一般熱極性、不穩定、具有氫鍵結果能力的農藥在氣相色譜殘留分析中較易產生基質效應，可能與三唑錫含有的胺基基團在酸性條件下不穩定，易分解有關。3種有機錫化合物在香蕉中的基質增強效應均比其它基質要強，可能與香蕉基質中含有較多的糖分、蛋白質等成分有關，在前處理過程中未得到有效的凈化。在基質效應存在的情況下，本試驗選取基質匹配標準曲線定量，可以一定程度上降低基質效應的影響，使定量結果更加準確。

2.5 方法的線性范圍、加標回收率、精密度和定量限

取0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L 6個質量濃度的三唑錫、三環錫和苯丁錫化合物，按優化色譜條件進樣1 μL，以峰面積為縱坐標，標準樣品的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程及相關系數見表2，以信噪比S/N≥3估算儀器的檢出限(LOD)，S/N≥10估算儀器的定量限(LOQ)，結果如下(見表2)。

表2 三唑錫、三環錫和苯丁錫化合物的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

稱取市售的大白菜、茄子、土豆、柑桔、蘋果5個樣品，分別添加0.010 0、0.020 0和0.050 0 mg/kg不同水平的3種有機錫化合物標準溶液進行回收率試驗，每個添加水平重復3次，加標回收結果(見表3)。3種有機錫化合物的平均回收率為76.2%～92.0%，相對標準偏差小于8.5%，符合GB/T 27404—2008附錄F中對檢測方法確認的要求。

表3 三唑錫、三環錫和苯丁錫化合物的加標回收率及相對標準偏差(n=3)

續表3

衍生化試劑檢測基質加標水平/(mg·kg-1)三唑錫三環錫苯丁錫回收率/%相對標準偏差RSD/%回收率/%相對標準偏差RSD/%回收率/%相對標準偏差RSD/%乙基溴化鎂四乙基硼化鈉乙基溴化鎂四乙基硼化鈉乙基溴化鎂四乙基硼化鈉柑桔0.0174.22.379.32.588.65.278.23.180.33.577.82.60.0283.35.583.51.878.03.388.81.185.32.377.42.50.0592.03.388.52.386.12.689.92.576.83.485.15.5乙基溴化鎂四乙基硼化鈉乙基溴化鎂四乙基硼化鈉乙基溴化鎂四乙基硼化鈉蘋果0.0177.54.777.76.680.36.680.26.379.35.881.25.30.0279.55.285.23.585.62.884.03.486.33.884.31.90.0577.82.289.62.189.51.585.64.790.51.990.51.2

2 結論

本試驗比較了乙基溴化鎂乙醚溶液、四乙基硼化鈉2種衍生化試劑用于3種有機錫化合物衍生化反應的優劣，2種衍生化試劑均可用于三唑錫、三環錫的衍生化反應檢測。苯丁錫采用2%四乙基硼化鈉水溶液衍生后產物響應較高，且該試劑在水介質和緩沖溶液中均可使用，對衍生條件要求較低且穩定，用途比乙基溴化鎂乙醚溶液更為廣泛。并對3種有機錫化合物在不同基質中的基質效應進行了探討，采用基質匹配標準曲線定量可以有效降低基質效應。采用優化后的GC-MS/MS方法，在空白樣品添加濃度為0.01、0.02、0.05 mg/kg的范圍內，3種有機錫化合物的平均回收率范圍為76.2%～92.0%，相對標準偏差小于8.5%，符合GB/T 27404—2008附錄F中對檢測方法確認的要求。因此優化后的該方法檢出限低、靈敏度高，適用于水果、蔬菜中有機錫化合物的定量檢測。

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