硅膠固相萃取-高效液相色譜法測定植物油中的特丁基對苯二酚含量

金瑚，熊巍林，包李林，周青燕，鄒燕娣，林俞霞

(道道全糧油股份有限公司，國家油菜籽加工技術研發分中心，湖南 岳陽，414000)

食用油脂在加工、貯存、使用過程中極易受到光、熱、酶、金屬離子等作用而發生氧化酸敗變質，尤其是富含不飽和雙鍵的植物油更易發生氧化變質。為防止食用油脂酸敗，產生對人體有害的物質， 生產廠家會其加入抗氧化劑。目前常用的氧化劑主要有丁基羥基茴香醚(butyl-hydroxyanisd，BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated-hydroxytoluene，BHT)、特丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone，TBHQ)、沒食子酸丙酯(propyl-gallate, PG)等，其中TBHQ的抗氧化性能是BHA、BHT、PG的2～5倍，且其熱穩定性好，低毒，具有抑制細菌和霉毒作用，遇金屬離子不著色等諸多優點而廣泛應用在食用植物油中[1-3]。但是攝入過量TBHQ也會對人體造成傷害[4-5]，我國食品添加劑使用衛生標準(GB 2760—2014)規定TBHQ使用的最大量為200 mg/kg。因此油脂中TBHQ應該謹慎監測。現行檢驗方法主要采用氣相色譜法[6-8]、薄層色譜法[6]、比色法[6]和高效液相色譜法[10-22]。油樣的前處理大多采用溶劑提取法，而采用固相萃取的前處理較少。本實驗采用硅膠作為吸附劑進行萃取，利用高效液相色譜進行測定TBHQ含量，為油脂中TBHQ含量的測定提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

硅膠(100～200 μm)，青島海洋化工；TBHQ標準品(純度≥99%)，滕州市天益工貿有限公司；甲醇(色譜純)，Sigma-Alorich;正己烷(分析純)，湖南匯虹試劑有限公司；二氯甲烷(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；不含TBHQ的葵花籽油，公司自給；洗脫液為A:100 mL正己烷/二氯甲烷混合液(體積比1∶1),B：50 mL二氯甲烷。

1.1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜(配有紫外檢測器)，安捷倫；RE-201型旋轉蒸發儀，上海越眾儀器設備有限公司；HGC-12A氮吹儀，天津市恒奧科技發展有限公司；玻璃層析柱d=1.2 cm，l=47 cm，帶砂芯配旋塞,上海宸喬生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜條件：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm)；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm；進樣量20 μL；流動相C為甲醇，流動相D為1%乙酸水溶液，梯度見表1。

1.2.2 標準溶液的繪制和儀器檢出限

稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)的TBHQ，用甲醇溶解并定量至100 mL，配制成1 mg/mL標樣儲備液。取一定量的標樣儲備液用甲醇分別稀釋配制成10、50、100、150、200、250 μg/mL標準使用液， 按照1.2.1

表1 流動相洗脫梯度

中的液相色譜條件進行分析，以標準液的濃度為橫坐標，其峰面積為縱坐標繪制標準曲線。其線性方程如式(1)所示，R2=0.998 6，以儀器的S/N=3計算，測得儀器最低檢出限為1 mg/kg。

Y=20.84×C+34.6

(1)

式中：Y為峰面積；C為TBHQ質量濃度，μg/mL。

A值的大小決定了定子內圓單位表面積所產生的繞組銅損的大小，因而直接影響溫升和效率的高低。在定子鐵心內徑確定的前提下，選擇不同的槽數可決定不同的A值， 電機定子槽數與電負荷的對

1.2.3 樣品的處理

向層析柱中濕法裝入15.0 g硅膠，稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)油樣，3～4 mL正己烷溶解上樣，待流完后棄去，加入100 mL A或50 mL B洗脫液，流速為1滴/s，用平底燒瓶收集洗脫液，旋蒸濃縮至近干，向平底燒瓶中加入石油醚清洗2次，每次1 mL，將清洗液轉移到 5 mL玻璃樣品瓶中，并在60 ℃的氮吹儀蒸發至干，加甲醇定容至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，上機測定。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理探討

鑒于TBHQ和植物油的極性相差較大，而TBHQ屬于酸性類物質，選用硅膠作為吸附劑，能滿足兩者的分離。能否準確測定油中的TBHQ含量，跟硅膠量、油樣量、洗脫劑的極性和用量有密切關系。本實驗以100 mg/kg葵花籽油為樣品，以測出該樣品的TBHQ含量和油脂凈化率高為目的來優化前處理過程。

2.1.1 硅膠量的影響

固定100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，油樣為0.1 g(TBHQ為10 μg)，流速為1滴/s。分別稱取10、15、20 g的硅膠進行試驗，結果發現：當硅膠量為20 g時，使得少量的TBHQ殘留在硅膠柱內沒有被洗脫出來；當硅膠量為10 g時，樣品組分在硅膠內未能進行有效的固液動態平衡分離，導致油脂沒被吸附就洗脫下來了；當硅膠量為15 g時，TBHQ和油脂能較好地分離。

2.1.2 洗脫劑的選擇

固定硅膠量為15 g，油樣0.1 g(TBHQ為20 μg)，流速為1滴/s。鑒于目標物TBHQ屬于較大的極性物質，因而選擇洗脫劑為有一定極性的有機溶液。主要選擇了揮發性較小，較為常見且揮發性較小，毒性較小的有機溶劑為正己烷和二氯甲烷。經過反復試驗證明：直接選用極性較大的二氯甲烷作為洗脫劑，TBHQ較易洗脫下來，但是需要控制洗脫劑的用量，否則，用量太大油脂也會一同洗脫下來。經試驗得知，單純使用二氯甲烷作為洗脫劑，且用量為50 mL可以滿足要求。當使用正己烷和二氯甲烷混合液時，需要配制合適的極性才能較好的分離TBHQ和油脂。經過反復試驗，當正己烷和二氯甲烷的體積比為1∶1時，100 mL混合洗脫液足以將20 μg的TBHQ洗脫下來。

2.1.3 洗脫流速的影響

固定硅膠量為15 g，100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，油樣為0.1 g(TBHQ為10 μg)。流速過大，樣品的洗脫時間縮短，但是吸附到硅膠上的組分還沒來得及擴散就隨著流動相洗脫出去了，使得分離效果差。流速過慢，使得分離時間也較長，組分在硅膠柱內的保留時間長，使得軸向擴散增大，不利于組分分離，經試驗反復證明，流速為1滴/s可以較好地分離TBHQ和油脂。

2.1.4 油樣量的影響

固定硅膠量為15 g，100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，流速為1滴/s。油樣量大，則更多油脂洗脫下來，油樣量小，若樣品的TBHQ含量少，則可能檢測不出來。經試驗證明，0.1 g的油樣量較為合適。

2.1.5 層析柱規格的影響

固定硅膠量為15 g，100 mL洗脫液A或50 mL洗脫液B，油樣為0.1 g(TBHQ為10 μg)，流速為1滴/s。分別選取內徑分別為1.2 cm和2.0 cm的層析柱進行試驗。試驗證明：當層析柱內徑為2 cm時，上同樣量的硅膠，層析柱內填充硅膠高度較矮，使得TBHQ和油脂分離不理想；而當使用內徑較小的層析柱時，硅膠高度較高，使分離效果較理想。

2.2 色譜分離條件

如圖1所示，樣品中的TBHQ與雜質能較好地分開，雜質峰不干擾測定。TBHQ的保留時間為6.227 min。將同一樣品在同一天內重復測定6次并取平均值計算儀器的精密度，測得變異系數RSD%為5.5%，說明儀器精密度良好。

圖1 樣品中TBHQ的色譜分離圖Fig.1 chromatographic separation figure of TBHQ in sample

2.3 方法的回收率和精密度

向不含TBHQ葵花籽油中添加TBHQ，配制濃度為500 mg/kg的儲備樣，繼續稀釋分別配制成60、100、250 mg/kg的標樣，分別稱取少于0.1 g(精確至0.000 1 g)的3種標樣，作為3個加標水平，按照試驗1.2.3樣品處理過程，每個加標樣水平進行3次平行測定，取平均值，計算3種方法的回收率和RSD%。測定結果見表2。

表2 TBHQ含量的回收率

由表2可知, 方法回收率在95.6%～103.7%， RSD%在3.5%～5.1%，說明該方法具有良好的準確性和重現性。

2.4 方法的最大萃取量

稱取含TBHQ為250 mg/kg的油樣0.1 g(精確至0.000 1 g)，按照1.2.3步驟處理油樣。實驗結果表明：100 mL的A洗脫液能洗脫21 μg TBHQ；50 mL的B洗脫液能洗脫16 μg TBHQ。

2.5 該方法測定結果與NY/T1602—2008農業行業標準的比較

由表3可知，該方法測出同一油樣的TBHQ含量基本與農業行業標準一致。

表3 比對實驗

2.6 樣品測定

對本公司葵花籽油中的TBHQ含量進行抽檢6批次，利用A洗脫液和B洗脫液分別抽檢3批次，按照1.2.3的前處理過程進行處理，其結果如表4所示。

表4 樣品中TBHQ含量

3 結論

采用硅膠作為吸附劑萃取植物油中TBHQ，利用反相液相色譜法測定其含量。本實驗對硅膠的用量、油樣量、洗脫劑的極性、流速和層析柱規格進行了優化組合。優化后的試驗，其回收率在95.6%～103.7%， RSD%在3.5%～5.1%，同一樣品的TBHQ含量測定結果與NY/T1602—2008測定的基本一致，說明該方法具有良好的準確性和重復性，可用于植物油中TBHQ含量的測定。

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