手足口病檢測中應用實時熒光定量PCR的應用效果

劉麗，羅瀅娟，李瓊，羅青，周信云，朱端昊

（吉安市疾病預防控制中心，江西 吉安 343000）

手足口病主要是指由腸道病毒引起的傳染性疾病，主要發生于5周歲以下的幼兒[1]，臨床癥狀主要表現為厭食、口痛、低熱、手部、足部及口腔等部位出現小潰瘍及小皰疹，嚴重影響患兒的生長發育，大部分患兒在一周內會自行康復，但少數患兒會引起肺水腫、心肌炎及無菌性腦膜炎等并發癥現象[2]，嚴重者甚至出現死亡現象。2014～2016年吉安市轄區內13個縣市區送來的疑似手足口病例經過分析發現，發病人群主要集中在5周歲以下的幼兒，且年齡越小發病率越高，發病時間持續在1周以內[3]，患兒發病的主要病原體以CoxA16及EV71感染為主。現階段的手足口病僅僅是針對已經出現疾病或癥狀的現象進行醫治，不利于患兒的成長及健康發育，因此，有效地檢測、預防及控制措施顯得尤為重要。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 了解2014年～2016年吉安市轄區內13個縣市區送來的疑似手足口病例標本87例作為觀察對象，87例手足口病患兒中男性患兒與女性患兒之間的比例為53:34，年齡1～5歲，平均年齡為（2.15±1.34）歲，其中出現低熱癥狀的患兒為41例，厭食癥狀的患兒50例，患兒手部、足部及口腔內均出現不同程度的潰瘍及皰疹現象。經過實驗室檢查后發現確診患兒為87例。

排除標準：存在嚴重器質損傷及基礎性疾病的患兒、不同意進行此次觀察的患兒（監護人不同意）及嚴重精神障礙患兒；納入標準：患兒年齡在5歲以下、患兒均存在不同程度的疑似手足口病的相關癥狀。

1.2 方法 實時熒光定量PCR檢測：取患兒咽拭子標準進行復溫后，按照試劑盒相關操作標準進行操作，分別進行CoxA16、EV、EV71的實時熒光定量PCR檢測及RT-PCR擴增及逆轉錄，采用生物安全柜實時熒光PCR儀ABI7300；試劑盒：腸道病毒RNA檢測試劑盒，采用19 μl的檢測混合液，標本5 μl，RT-PCR酶1μl反應條件調整為：10min的45℃，15 min的95℃，15 s的95℃、1 min 60℃進行操作，連續循環操作40次。手足口病病原體檢測試劑為通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒，診斷標準為相關試劑盒的核酸檢測陽性結果為主。

1.3 觀察指標 將熒光定量PCR檢測的結果與實驗室檢查結果進行對比分析，觀察實時熒光定量PCR檢測的靈敏度、準確性、特異性及陽性率。

1.4 統計學方法 本研究數據均用SPSS 18.0統計軟件處理，計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR檢測及實驗室檢查對于檢測手足口病的陽性率 實時熒光定量PCR檢測及實驗室檢查對于診斷手足口病的檢測陽性率比較差異無統計學意義，見表1。

表1 兩種檢測方式對于手足口病的檢測陽性率比較（n）Table 1 Comparison of the positive rates of two kinds of detection methods for hand foot mouth disease(n)

2.2 實時熒光定量PCR檢測的靈敏度、準確性、特異性 實時熒光定量PCR檢測診斷手足口病的敏感度為95.24%，特異度為75.00%，準確性為93.10%。實時熒光定量PCR檢測與實驗室檢查結果比較見表2。

表2 實時熒光定量PCR檢測與實驗室檢查結果對比Table 2 Comparison of real time fluorescence quantitative PCR detection and laboratory examination

3 討論

臨床報道指出：腸道病毒中的EV71病毒感染的患兒均伴隨較為嚴重的神經系統并發癥出現，具有較大的危害力及致死率，而CoxA16感染引起的手足口病預后較好，出現死亡現象及并發癥現象的可能性較低[4]。2014～2016年吉安市轄區內13個縣市區出現的手足口病病例主要以5周歲以下的男性幼兒為主，且大部分患兒的發病時間集中在5～10月份[5]，發病持續時間為2～7 d左右，其中2～4歲的患兒發病率最高。隨著人們生活環境及細菌的滋生等現象，手足口病的發病率呈現逐年增長的趨勢，5周歲以上兒童發病率較少[6]，其顯著影響了患兒的正常發育及成長。

腸道病毒感染引起的手足口病的潛伏期為一周內左右，患兒出現感染癥狀后會獲得病毒的免疫力[7]，不同型別的病原感染后抗體不存在交叉保護作用[8]，手足口病的分布較為廣泛，一年中以夏秋季節較為多見，病毒的隱性感染較強，因此早期的檢測及診斷顯得尤為重要。酶聯免疫吸附試驗檢測手足口病的檢測陽性率較低，且靈敏度不高，具有一定的局限性[9]；而實時熒光定量PCR檢測具有以下特點：分析檢測過程中由PCR儀完成操作，不需要進行紫外燈及電泳的觀察，減少了操作的復雜過程，加快了檢測的進程及速度[10]，提高了檢測的可靠性，在完全閉管的情況下進行逆轉錄及擴增反應能有效減少或避免PCR產物的污染現象[7]；實時熒光定量PCR法的檢測時間較短，全程只需要3 h左右，將腸道病毒的檢測時間大大縮短，為手足口病的診斷提供了相關的實驗室手段[11]，為臨床治療中對癥治療提供了參考依據。實時熒光定量PCR檢測通過對CoxA16及EV71感染的病例進行對比分析后得知，CoxA16及EV71感染引起的手足口病患兒在臨床癥狀及表現方面的差異較小，但CoxA16感染引起手足口病患兒的預后較好，且病情較輕；而EV71感染引起手足口病患兒的臨床癥狀較為嚴重，極易導致神經源性肺水腫及腦干腦炎等并發癥的出現，嚴重的患兒甚至存在生命危險，這一結果與臨床報道基本一致。因此，采用實時熒光定量PCR檢測對于診斷患兒病情及制定治療方案具有一定的積極作用。本次觀察的結果數據顯示，采用實時熒光定量PCR檢測對于手足口病患兒的檢測陽性率明顯較高，說明實時熒光定量RCP檢測的靈敏度及特異性較高，值得臨床檢驗的推廣使用。

綜上所述，實時熒光定量PCR在手足口病檢測中的應用效果較為顯著，能為疾病的預防與控制提供指導性數據。

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