含鉻革屑堿酶結合法提取水解膠原蛋白

王小卓，溫會濤*，梁永賢，楊義清，王坤余，但衛華

（1.興業皮革科技股份有限公司，福建晉江362261；2.福建省皮革綠色設計與制造重點實驗室，興業皮革科技股份有限公司，福建晉江362261；3.四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川成都610065）

1 引言

皮革行業是我國輕工行業的支柱產業，為經濟發展做出了重要貢獻，但隨著制革規模不斷擴大，產能無序擴張，帶來了一定的環境污染問題[1]。據統計[2-4]，1t原料皮只能產出200 kg成品革，卻會產生超過600 kg固體廢棄物，其中被列入危險固廢的含鉻皮類固廢約為250 kg，其主要成分為膠原蛋白和Cr2O3，以干基計，含鉻廢棄物中Cr2O3含量約為4.0%，膠原蛋白含量約為80%[5-6]，若采用傳統的填埋方法，不僅會給環境帶來極大的污染，而且會造成資源的大量浪費。

含鉻廢棄物資源化利用可以不脫鉻直接利用，也可以脫鉻后分別回收鉻和膠原蛋白進行高值利用[7]。脫鉻是破壞鉻與膠原羧基的配位鍵，從而使鉻與膠原分離。按照水解助劑的不同，水解方法可分為氧化法、酸法、堿法、酶法和綜合法等[8]。氧化法脫鉻不徹底，需多次重復脫鉻，造成膠原損失和成本增加，而且易產生劇毒的Cr6+；酸法對膠原分子降解較大，產物相當分子質量較小，膠原提取率和脫鉻率都比較低，而且酸液對設備的腐蝕較大；堿法對膠原分子降解較大，產物分子量較小，但是膠原提取率和脫鉻率都較高；酶法反應條件溫和，對膠原蛋白分子破壞較小，是一種較優越的水解方法，但是膠原提取率和脫鉻率都較小。堿法水解具有較高的膠原提取率和脫鉻率，但是仍會殘留部分未水解完全的鉻渣，采用酶法對鉻渣進行二次水解，可進一步提高膠原提取率。

利用含鉻廢棄物經脫鉻制備皮革化學品，使制革含鉻固體廢棄物在制革行業封閉循環利用，是對生物質資源——膠原蛋白和國家戰略性資源——鉻的高值再利用。

2 實驗部分

2.1 實驗材料與儀器

2.1.1 主要材料

含鉻革屑，興業皮革科技股份有限公司鞣制后削勻產生的革屑；氧化鈣，AR，西隴化工股份有限公司；氫氧化鈉，AR，西隴化工股份有限公司；二水合草酸，AR，西隴化工股份有限公司；碳酸氫鈉，AR,廣東汕頭達濠精細化學品有限公司；氧化鎂，AR，廣東汕頭達濠精細化學品有限公司堿性蛋白酶，生物試劑，上海藍季科技發展有限公司；中性蛋白酶，生物試劑，上海藍季科技發展有限公司。

2.1.2 主要儀器

PHSJ-4F型pH計，深圳市華鑫計量儀器有限公司；KD-2100TEC型精密電子天平（精密度0.01g），福州科迪電子技術有限公司；JJ224BC型精密電子天平（精密度0.0001g），常熟市雙杰測試儀器廠；HZS系列水浴恒溫振蕩器，金壇市科欣儀器有限公司；DK-98-II型電子調溫萬用電爐，天津市泰斯特儀器有限公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 含鉻革屑預處理

首先用自來水沖洗削勻含鉻革屑3-4遍；然后加入洗滌劑揉搓，用自來水沖洗后再重復沖洗至干凈為止；最后將洗滌干凈的含鉻革屑烘至恒重，置于干燥器中保存，備用。

2.2.2 含鉻革屑堿法水解

在三角瓶中加入5g含鉻革屑，50g水，0.3 g堿性材料，攪拌均均，置于（70±0.2）℃的恒溫水浴振蕩器中反應3h，冷卻后抽濾，得到膠原水解液；并探討堿性材料用量、反應溫度、反應時間對含鉻革屑脫鉻率及膠原蛋白提取率的影響。

2.2.3 含鉻殘渣酶法水解

在三角瓶中加入5 g經堿性材料處理后的含鉻殘渣，按表1所示的方法加入蛋白酶，控制反應溫度、反應pH，冷卻后抽濾，得到膠原水解液；并探討酶種類、酶用量、酶反應溫度、酶反應pH對膠原蛋白提取率的影響。

2.3檢測方法

2.3.1 含鉻革屑主要技術指標

水分含量參照輕工行業標準（QB/T 2717-2005）進行測定[9];Cr2O3含量參照輕工行業標準（QB/T 2720-2005）進行測定[10];pH參照輕工行業標準（QB/T 2724-2005）進行測定[11];灰分含量參照輕工行業標準（QB/T 1274-2012）進行測定[12]。

2.3.2 膠原蛋白提取率

采用重量分析法進行檢測。將膠原水解液過濾2-3次，濾液定容至100m L，用移液管移取10m L至稱量瓶中，放入（102±2）℃烘箱烘至恒重，在干燥器中冷卻至室溫，稱量，可采用下式計算膠原蛋白提取率。

式中：W—膠原蛋白提取率（%）；

m0—稱量瓶的質量（g）；

m1—含鉻革屑干重（g）；

m2—稱量瓶和干燥后膠原水解物質量（g）。

2.3.3 膠原蛋白鉻含量

將膠原水解液過濾2-3次，干燥得到膠原蛋白粉，參照輕工行業標準（QB/T 2720-2005）測定膠原蛋白中Cr2O3含量[10]。

2.3.4 脫鉻率

從2.3.1、2.3.3中分別得到含鉻革屑、膠原蛋白中的鉻含量，可采用下式計算脫鉻率。

式中：W—脫鉻率（%）；

C1—含鉻革屑鉻含量（m g/g）；

C2—膠原蛋白鉻含量（m g/g）。

3 結果與分析

3.1 含鉻革屑主要技術指標

含鉻革屑為興業皮革科技股份有限公司鞣制后削勻產生的革屑，經檢測，其pH值，水分含量，灰分含量，Cr2O3含量如表2所示。

從表2可以得到含鉻革屑膠原蛋白含量約為80%，Cr2O3含量約為4%，若不加以回收利用，將會造成大量的資源浪費，同時會對環境帶來一定的污染。

3.2 堿性材料對比

分別采用 CaO、MgO、NaOH、NaHCO3四種堿性材料水解含鉻革屑，以膠原提取率和脫鉻率為評價指標，其結果如圖1所示。

從圖 1可以看出，用 NaOH、CaO、MgO、NaHCO3水解含鉻革屑，膠原提取率依次為87.5%，56.3%、53.7%、13.4%，脫鉻率依次為 90.16%、98.38%、98.18%、89.69%。NaOH會對膠原蛋白造成嚴重破壞，所得蛋白分子量很小，且過量NaOH可與Cr(OH)3反應生成水溶性NaCrO2，使得膠原水解液鉻含量增大。CaO、M gO反應溫和，其中CaO水解法膠原提取率、脫鉻率優于M gO水解法，且CaO價格更便宜，故采用CaO為進行水解含鉻革屑。

3.3 CaO法水解條件優化

CaO水解含鉻革屑，反應條件溫和，脫鉻率和膠原提取率較高，所得水解液鉻含量低，而且CaO價格便宜，故對CaO水解法進行優化，探討CaO用量、反應溫度、反應時間對含鉻革屑脫鉻率及膠原提取率的影響。

3.3.1 C aO用量對膠原提取率和脫鉻率的影響

表1 蛋白酶處理鉻屑殘渣的條件Tab.1 The conditions of protease for treating chrome residues

表2 含鉻革屑主要技術指標Tab.2 Main qualification of chrome shavings

圖1 不同堿性材料水解效果比較Fig.1 Com parisonofdifferentalkalinematerials forhydrolyzingeffect

圖2 CaO用量對膠原提取率和脫鉻率的影響Fig.2 Influence of Cao dosage for collagen extraction rate and dechrom ing rate

圖3 CaO反應溫度對膠原提取率和脫鉻率的影響Fig.3 Influence of CaO reaction tem perature for collagen extraction rate andchrom ing rate

圖4 CaO反應時間對膠原提取率和脫鉻率的影響Fig.4 Influence of CaO reaction time for collagen extraction rate and dechrom ing rate

在反應溫度為70℃，反應時間為5 h的條件下，采用4%、6%、8%和10%的CaO對含鉻革屑進行水解，膠原提取率和脫鉻率如圖2所示。

從圖2可以看出，膠原提取率隨CaO用量增加而增大，當用量達到8%后趨于穩定。當CaO用量由4%增加至8%時，膠原提取率由14.0%增大至73.5%，增幅為425%；當CaO用量由8%增加至10%時，膠原提取率由73.5%增大至75.8%，增幅僅為3.13%。CaO溶于水生成Ca(OH)2電離出OH-，反應體系中OH-濃度是影響膠原提取率的主要因素。當CaO用量較低時，隨CaO用量地增加，反應體系OH-濃度增大，膠原提取率隨之增大，但是Ca(OH)2在水中的溶解度不高，隨CaO用量進一步增加，部分Ca(OH)2以白色沉淀的形式出現，反應體系中的OH-濃度并不會增加，因此膠原提取率不會隨之增加，而是趨于穩定。

從圖2可以看出，脫鉻率隨CaO用量地增加先增大后趨于穩定。當CaO用量為4%時，脫鉻率為87.97%；當CaO用量介于8%～10%時，脫鉻率趨于穩定，達到99.96%左右，此時膠原蛋白鉻含量僅為0.012m g/g，脫鉻率為99.96%。CaO的引入必然會使膠原水解液灰分含量增大，因此為保持較高的膠原提取率并避免水解液灰分過多地增大，確定CaO最佳用量為8%。

3.3.2 C aO反應溫度對膠原提取率和脫鉻率的影響

反應溫度直接影響反應速率，在規定時間內反應速率直接影響膠原提取率和脫鉻率。在CaO用量為8%，反應時間為5h的條件下，改變反應溫度進行含鉻革屑水解實驗，探討反應溫度對膠原提取率和脫鉻率的影響，其結果如圖3所示。

從圖3可以看出，膠原提取率隨反應溫度地升高先增大后趨于穩定。當反應溫度由60℃升高至70℃，膠原提取率由38.0%增大至74.2%，增幅為95.26%；當反應溫度由70℃升高至75℃時，膠原提取率由74.2%增大至76.0%，增幅僅為2.43%。反應溫度變高，反應速率增大，膠原提取率表現出快速增大的現象；但溫度升至一定值后，反應體系逐漸趨于動態平衡，反應速率逐漸趨于穩定，膠原提取率表現出趨于平穩的現象。

從圖3可以看出，脫鉻率隨反應溫度地升高先增大后趨于穩定。當反應溫度為60℃時，脫鉻率最低，為89.61%，當反應溫度介于70-75℃時，脫鉻率趨于穩定，達到99.61%左右，此時膠原蛋白鉻含量僅為0.018m g/g，脫鉻率為99.61%。反應溫度越高越易造成Cr3+轉化為Cr6+[13]，危害人體健康，故確定CaO最佳反應溫度為70℃。

3.3.3 C aO反應時間對膠原提取率和脫鉻率的影響

在CaO用量為8%，反應溫度為70℃的條件下，改變反應時間進行含鉻革屑水解實驗，探討反應時間對膠原提取率和脫鉻率的影響，其結果如圖4所示。

由圖4可以看出，膠原提取率隨反應時間地增加先增大后趨于穩定。當反應時間由1 h增加至3 h，膠原提取率由42.0%增大至52.0%，增幅為23.81%；當反應時間由3 h增加至5 h，膠原提取率由52.0%增大至74.2%，增幅為42.69%；當反應時間由5 h增加至7 h，膠原提取率由74.2%增大至76%，增幅僅為2.43%。當膠原提取率達到74.2%時，說明水解反應已經接近終點，再增加時間不會對膠原提取率帶來很明顯地增長。

由圖4可以看出，脫鉻率隨反應時間地增加先增大后趨于穩定。其中，當反應時間為1h時脫鉻率最低，為88.16%；當反應時間介于5～7h時，脫鉻率趨于穩定，達到99.56%左右，此時膠原蛋白鉻含量僅為0.021 m g/g，脫鉻率為99.56%。由于反應時間越長，能耗越大，故確定CaO最佳反應時間為5 h。

綜上所述，CaO法水解含鉻革屑的最佳作用條件為CaO用量8%，反應溫度70℃，反應時間5 h。

圖5 酶用量對膠原提取率的影響Fig.5 Influence of protease dosage for collagen extraction rate

圖6 酶反應溫度對膠原提取率的影響Fig.6 Influence of protease reaction tem perature for collagen extraction rate

圖7 酶反應pH對膠原提取率的影響Fig.7 Influence of protease reaction pH for collagen extraction rate

3.4酶法水解條件優化

為進一步提高膠原提取率，采用蛋白酶對CaO水解后的殘渣進行二次水解，探討酶種類、酶用量、酶反應溫度、酶反應pH對膠原提取率的影響。

3.4.1 酶用量的影響

改變酶用量進行含鉻革屑水解實驗，分別探討中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶用量對膠原提取率的影響，其結果如圖5所示。

由圖5可以看出，膠原提取率隨酶用量地增加先增大后趨于平穩。當中性蛋白酶用量由2%增加至4%時，膠原提取率由14.0%增大至20.6%，增幅為47.14%；當中性蛋白酶用量超過4%時，膠原提取率增速明顯降低。當堿性蛋白酶用量由2%增加至6%時，膠原提取率由4.0%增大至11.5%，增幅為187.5%；當堿性蛋白酶用量超過6%時，膠原提取率增速明顯降低。酶用量較低時，底物濃度大大超過酶濃度，反應速度隨酶濃度的增加而增大，但是酶濃度增加到一定值后，酶促反應速率趨近于最大值，趨于穩定。堿性蛋白酶的最佳用量為6%，膠原提取率為11.5%；中性蛋白酶最佳用量為4%，膠原提取率為20.6%，此時膠原蛋白鉻含量僅為0.010m g/g。

3.4.2 酶反應溫度的影響

蛋白酶對溫度較為敏感，在一定溫度范圍內才能保持較高的活力，溫度偏低會抑制酶的活性，溫度過高則會導致蛋白酶變性從而失去活力。改變反應溫度進行含鉻革屑水解實驗，分別探討中性蛋白酶和堿性蛋白酶反應溫度對膠原提取率的影響，其結果如圖6所示。

從圖6可以看出，中性蛋白酶隨溫度地升高，膠原提取率先增大后降低。當溫度為37℃時，膠原提取率最大，達到21.5%。中性蛋白酶只有在37℃時才易溶于水，溫度低于或者高于37℃時，會有部分蛋白酶以沉淀的形式存在，反應體系中酶濃度降低，膠原提取率受到限制。堿性蛋白隨溫度地升高，膠原提取率先增大后趨于平穩。當反應溫度由40℃升高至47℃時，膠原提取率由4.0%增大至11.8%，增幅為195%；溫度繼續升高至50℃時，膠原提取率僅增大至12.2%，增幅僅為3.39%。堿性蛋白酶最佳水解溫度為47℃，當溫度超過47℃時膠原提取速率明顯降低，說明酶的活力受到了抑制。堿性蛋白酶最適反應溫度為47℃，膠原提取率為11.8%；中性蛋白酶最適反應溫度為37℃時，膠原提取率為21.5%，此時膠原蛋白鉻含量僅為0.020 m g/g。

3.4.3 酶反應pH的影響

pH對酶的活力影響很大，在最適的pH條件下才能使酶的作用達到最大，過高或過低的pH都會使酶的空間構象發生改變，從而使酶失去活力。改變反應體系pH進行含鉻革屑水解實驗，分別探討中性蛋白酶和堿性蛋白酶反應pH對膠原提取率和脫鉻率的影響，其結果如圖7所示。

由圖7可以看出，中性蛋白酶隨pH地升高，膠原提取率先增加后降低。當反應體系pH為7.5時，酶活性達到最佳，膠原提取率最大，達到20.3%，此時膠原蛋白鉻含量僅為0.020m g/g。堿性蛋白酶隨pH地升高，膠原提取率先緩慢增大，后快速增大。當反應體系的pH為10.0時，膠原提取率為12.0%，膠原蛋白鉻含量為0.020m g/g；當pH超過10.0時，膠原提取率表現出快速增大，說明反應體系中OH-成為水解革屑的主要因素，酶活性降低或已失活，含鉻革屑在堿的作用下快速水解，同時Cr(OH)3與OH-進一步反應生成水溶性NaCrO2，使得膠原水解液鉻含量大幅增加。堿性蛋白酶最適反應pH為10.0，膠原提取率為12.0%；中性蛋白酶最適反應pH為7.5，膠原提取率為20.3%，此時膠原蛋白鉻含量僅為0.020 m g/g。

綜上所述，中性蛋白酶提取膠原蛋白的效果要好于堿性蛋白酶，最佳作用條件為中性蛋白酶用量4%，反應溫度37℃，反應pH 7.5。

3.5 CaO-中性蛋白酶結合法水解

上述3.3、3.4分別對CaO、蛋白酶水解條件進行了優化，得出了CaO、蛋白酶的最佳作用條件。在其基礎上，進行“CaO-中性蛋白酶”結合法水解含鉻革屑的驗證實驗，得到含鉻革屑在CaO、中性蛋白酶最佳作用條件下，膠原提取率為77.45%，脫鉻率為99.71%，膠原蛋白鉻含量為0.018m g/g。

4 結論

（1）采用 NaOH、CaO、MgO、NaHCO3水解含鉻革屑，CaO最佳，膠原提取率為56.3%，脫鉻率為98.38%。

（2）CaO法水解含鉻革屑的最佳條件為：CaO用量8%，反應溫度70℃，反應時間5h。

（3）中性蛋白酶提取膠原蛋白的效果要好于堿性蛋白酶，最佳作用條件為：中性蛋白酶用量4%，反應溫度37℃，反應pH 7.5。

（4）采用“CaO-中性蛋白酶”結合的方法水解含鉻革屑，膠原提取率達77.45%，脫鉻率達99.71%，膠原蛋白鉻含量為0.018 m g/g。

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