基于碳納米管富集凈化作用 和電化學特性的真菌毒素檢測方法研究進展

馬 帥,王紀華,馮曉元,姜冬梅,韋迪哲,王 蒙

(北京農業質量標準與檢測技術研究中心,農業部農產品質量安全 風險評估實驗室(北京),農產品產地環境監測北京市重點實驗室,北京 100097)

真菌毒素(mycotoxins)是產毒絲狀真菌生長繁殖過程中產生有致病性和致死性的有毒次生代謝產物[1],主要污染谷物和油料作物[2]。據統計全世界每年約有25%的農產品被真菌毒素所污染,造成數百億美元的經濟損失[3]。真菌毒素具有性質穩定、熔點高、毒性強等特點,谷物產品一旦被污染,利用常規的加工技術很難去除,因此在谷物食品和飼料中就會產生毒素殘留,對人畜健康造成嚴重威脅。快速、簡便、高效測定谷物中的多種真菌毒素的方法,為谷物樣品的高通量快速篩查提供可靠的技術支持,對于確保糧食及飼料安全,降低農業損失,降低真菌毒素對人類的影響和傷害,減輕糧食危機以及規避貿易壁壘具有重要的意義。本文根據真菌毒素的污染特點及碳納米管的結構性能,對基于多壁碳納米管的真菌毒素檢測技術研究進行綜述,并對真菌毒素檢測技術發展的新趨勢進行展望。

1 碳納米管結構性能

碳納米管(Carbon Nanotubes,CNTs),是1991年由日本納米科學家飯島澄男(Sumio Iijima)用高分辨透射顯微鏡觀察電弧蒸發石墨產物時發現的一種具有獨特物理化學性能的新型納米材料[4]。碳納米主要由呈六邊形排列的碳原子構成的單層或數層同軸圓管組成,具有特殊的一維中空結構。按照其管壁碳原子構成的層數可分為:單壁碳納米管(Single-Walled Carbon Nanotubes,SWCNTs)和多壁碳納米管(Multi-Walled Carbon Nanotubes,MWCNTs)。SWCNTs是由單層石墨片卷曲形成的管狀物,內徑為1～2 nm,具有良好的對稱性;MWCNTs則是由多層石墨片卷曲后形成的管狀物,內徑為2～20 nm,層間的距離約為0.34 nm,每層納米管都是一個由碳原子通過sp2雜化與周圍3個碳原子完全鍵合后形成的六邊形平面而組成的圓柱面[5-6]。

碳納米管由于其出色的性能和特殊的一維量子結構,使其在納米電子器件、儲氫材料、加工技術及生命科學[7-11]等眾多領域表現出了潛在的價值和廣泛的應用前景。研究發現[12-13],碳納米管除了良好的化學穩定性之外,還具有許多超常特性:碳納米管的管狀和螺旋結構使其具有優異的電磁性能;碳納米管有較大的長徑比,使其具有較強的導熱性能;納米級的中空管狀結構具有較輕質量密度、較大比表面積、較強氫鍵和π-π堆積作用等優點,使其對多種有機污染物具有很好的吸附性能。已有研究表明,碳納米管作為吸附材料可以成功富集樣品中的有機化合物[14-17]、金屬離子[18]和有機氣體[19],有效地提高了分析方法的靈敏度,而且具有可重復使用的性能。這些特性使其在農產品與食品質量安全檢測方面有良好的應用前景。

2 真菌毒素的污染特點及檢測技術研究進展

2.1 真菌毒素的污染特點

在已知的200多種真菌毒素中,黃曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素A(ochratoxin,OTA)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、伏馬菌素(fumonisin,FBs)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和展青霉素(patulin,PAT)是常見危害較大的毒素[20],其中AFB1是目前發現毒性最強的毒素[21]。真菌毒素對農作物和食品的污染有如下特點:一是大多在μg/kg或ng/kg低水平級;二是毒素污染分布很不均勻;三是毒素種類多樣,一種菌可產生多種毒素,同種毒素亦可由多種菌產生[22]。不同真菌毒素所侵染作物也有差異,AFs主要污染玉米和花生,同時毒素可通過食物鏈間接污染乳制品及肉類[23]。OTA在多種農作物中分布廣泛且污染水平較高[24]。FBs主要污染玉米及其制品,ZEN多存在于大麥和燕麥等谷物[25]。DON主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物[26]。PAT主要存在于水果、蔬菜、面包和肉類制品之中[27]。

2.2 真菌毒素的危害及致病機理

真菌毒素可直接污染植物及其產品,也可通過被污染的飼料進入動物組織中,從而通過食物鏈的逐級傳遞對人類健康產生威脅。食品中幾種常見真菌毒素的致病機理大致如下:AFs具有強致癌性和強免疫抑制性,抑制DNA、RNA的合成,破壞凝血機制及某些酶類[28];OTA對免疫系統和特異性腎有毒性,抑制ATP酶、琥珀酸脫氫酶以及細胞色素C氧化酶[29];ZEN具有雌性激素作用,對發育及生殖系統有很強的影響和破壞作用[30];FBs具有較強的肝臟和腎臟毒性;DON主要破壞細胞膜和酶類的功能,對造血系統和免疫系統有較強的毒作用;展青霉素是一種有毒內酯,具有潛在的致癌性和誘變性[31]。

2.3 真菌毒素的檢測方法發展現狀

目前,真菌毒素的檢測方法主要生物鑒定法、化學分析法、免疫分析法和儀器分析法[32]。生物鑒定法特點是對待檢樣品純度要求不高,主要作為真菌毒素的定性方法,但由于此方法專一性不強、靈敏度較低且實驗周期較長,一般只作為化學分析法的佐證。化學分析法最常用的是薄層層析法,該法雖然經濟實用,但定量效果、重復性和再現性較差。免疫分析法是利用抗原抗體反應原理來構建的一類較新的真菌毒素分析方法,主要包括酶聯免疫吸附法、免疫熒光法和放射免疫法等，具有高靈敏度、高特異性、前處理簡單和易于推廣等優點[33-34],但該方法檢測真菌毒素存在一定的假陽性,且抗體的制備時間長、成本高。儀器分析法是基于色譜質譜技術的檢測方法,主要包括高效液相色譜法和液相色譜串聯質譜法[35-37]，是目前真菌毒素檢測的主要方法,高效快速分析能力為同時測定多種真菌毒素提供了條件,并通過與質譜技術聯用提高分析的靈敏度和可靠性,但其對樣品的前處理要求高,對操作人員技術要求高,且儀器設備價格昂貴。

3 基于碳納米管的真菌毒素檢測方法研究進展

3.1 基于碳納米管結構特性的真菌毒素前處理方法

碳納米管在樣品前處理技術中的應用,按樣品前處理方法大致可分成以下幾類：

3.1.1 固相萃取法(Solid-phase extraction,SPE) SPE是基于固-液相色譜理論的樣品前處理技術,基本原理是利用固體吸附劑提取溶液中的目標化合物或吸附雜質,實現目標化合物的凈化和富集,SPE是目前微量、痕量檢測中最常用的凈化技術[38]。碳納米管具有較大的比表面積、較強的氫鍵和π-π堆積作用等優點,使其在固相萃取真菌毒素、農藥殘留和重金屬等方面有良好的應用前景。

Dong Mao feng等[39]采用MWCNTs為吸附劑的SPE技術與超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)法結合測定玉米、小麥和大米中的4種A型單端孢霉素(T-2毒素、HT-2毒素、新茄病雪腐鐮刀菌烯醇和蛇形毒素),結果表明:MWCNTs的凈化效果受pH影響很大,優化后采用正己烷提取、5%甲醇水溶液淋洗和1%甲酸甲醇洗脫可獲得最佳提取效果,方法回收率為73.4%～113.7%,精密度為1.2%～17.1%,定量限為0.02～0.10 μg/kg,該方法對谷物中A型單端孢霉素的風險監測有重要作用。Brbara Socas-Rodríguez等[40]建立了以多壁碳納米管作為SPE吸附劑的超高效液相色譜串聯質譜法，測定水樣和嬰兒奶粉中由鐮刀菌產生的6種真菌毒素(玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇),研究者對多壁碳納米管類型、多壁碳納米管量以及洗脫液體積進行了優化。該方法在水樣品和奶粉樣品中的回收率分別為85%～120%和77%～115%,方法檢出限分別為0.05～2.90 μg/L和2.02～31.9 μg/L,該方法具有簡單、快速和環保的特點。已知的200多種真菌毒素中,仍有多種真菌毒素的檢測方法未見報道,將碳納米管優良的吸附特性與SPE技術相結合,可以開發多種真菌毒素聯合測定的方法。

3.1.2 分散固相萃取法(Dispersive solid phase extraction,dSPE) dSPE是近年發展起來的樣品前處理技術,該方法使用分散的萃取劑提取和凈化樣品中的目標物,由于其簡便高效和溶劑用量少等優點而日趨普及。目前,最經典的分散固相萃取法是QuEChERs法[41],由于碳納米管優良的吸附特性,可作為QuEChERs法中的吸附劑,用于真菌毒素的提取凈化。

彭曉俊等[42]建立了QuEChERS-改性多壁碳納米管提取凈化結合液相色譜-質譜聯用技術，同時，檢測新會陳皮中6種真菌毒素的分析方法,并對提取溶劑和多壁碳納米管用量進行了優化。在優化實驗條件下,目標化合物在各自線性范圍內均具有良好的線性關系,相關系數為0.9838～0.9982,檢出限(S/N=3)為0.18～10 μg/kg。在低、中、高3個加標水平的平均回收率為72.4%～106%,相對標準偏差為2.2%～7.4%。該法準確、靈敏度高﹑操作簡單快速,可應用于真菌毒素的快速篩查和確證。應永飛[43]采用多壁碳納米管為吸附劑,建立了dSPE凈化結合液相色譜-串聯質譜，測定飼料中的6種玉米赤霉烯酮類霉菌毒素(玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇)的方法。研究者對多壁碳納米管提取時間、用量和類型以及洗脫液體積等條件進行了優化,方法回收率為94.6%～107.3%,檢測限為0.12～0.27 μg/kg,該方法可以簡便、快速和準確的測定飼料中的6種玉米赤霉烯酮類霉菌毒素。

3.1.3 磁固相萃取(Magnetic solid phase extraction M-SPE) 最近,磁性固相萃取得到了越來越多的關注[44-46],它利用磁性材料與吸附劑形成磁性吸附劑,可以由外部磁場通過一個簡單的洗滌操作收集和回收,從而避免了傳統SPE吸附材料存在固液分離困難的缺點,實現快速和簡單的程序。磁性CNTs復合材料具有π-π 鍵相互作用、較大的比表面積及中空結構,可將其作為固相萃取吸附劑，用于富集與檢測不同樣品基質中的金屬離子和有機化合物等。此外,CNTs表面修飾磁性納米顆粒有助于復合材料吸附目標物后實現快速固液分離,為樣品的前處理技術提供了新的思路與方向。目前,最常見CNTs與磁性氧化鐵納米顆粒的復合主要包括CNTs管內填充和表面包覆磁性納米顆粒兩類。前者是通過一定技術手段將磁性顆粒填充至CNTs的腔體內,常用的填充方法主要有化學氣相沉積法和毛細管吸附法[47],包覆技術主要包括自組裝法、溶劑熱法和共沉淀法[48]。由于方便、簡單、成本低和速度快等優點已被成功地用于測定生物分子、醫藥產品、環境和食品污染物[49-51]等。

Mao feng Dong等[52]采用化學共沉淀法制備了Fe3O4-MWCNT磁性納米材料并進行了表征,建立了以Fe3O4-MWCNT為吸附劑UPLC-MS/MS聯用的磁固相萃取法，測定薏苡仁中的4種A型單端孢霉素(T-2、HT-2、NEO和DAS),該方法對提取溶液、解吸溶劑和M-MWCNT用量幾個關鍵參數進行了優化,方法定量限0.3～1.5 μg/kg,回收率73.6%～90.6%(R2>0.99),可簡便快速測定薏苡仁中的4種真菌毒素。Zheng Han等[53]采用MWCNT-MNPs作為M-SPE吸附劑,與UPLC-MS/MS聯用測定玉米中的6種玉米赤霉烯酮類霉菌毒素(玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇)。研究者通過對提取溶劑、解析溶劑、解析時間及MWCNT-MNPs用量進行優化,回收率達75.8%～104.1%,檢測限為0.03～0.04 μg/kg,高效快速測定玉米樣品中的玉米赤霉醇類毒素。

3.2 基于碳納米管電學特性的真菌毒素檢測方法

電化學免疫傳感器,將特異性的免疫反應同具有高靈敏度的傳感技術相結合,其中抗原和抗體為分子識別原件,與電化學傳感原件直接接觸并通過傳感元件將濃度信號轉化為相應的電信號的檢測方法。在電化學免疫傳感器的研制過程中,許多物質被用來放大傳感器的信號,進而提高傳感器的靈敏度,其中包括銀納米粒子(AgNPs)[54]、金納米粒子(AuNPs)[55]、量子點和碳納米管等材料[56-57]。由于其良好的韌性、穩定的化學性、較強的導電性和理想的比表面積等碳納米管被廣泛運用于電化學免疫傳感器的研究。電化學免疫傳感器法具有靈敏度高、選擇性好、價格更低廉,并且可以現場快速檢測等特點,已經被廣泛運用于食品分析、生物醫學、工業生產和環境檢測等領域。

馮甜等[58]研制了一種基于單壁碳納米管/殼聚糖(SWNTs/CS)復合納米材料固定抗原的間接競爭電化學免疫傳感器,可以靈敏檢測AFB1。在優化的實驗條件下,該方法的線性范圍從0.01～100 ng/mL,檢出限達到3.5 pg/mL。與傳統的分析方法相比,所構建的免疫傳感器具有更高的靈敏度,且更加簡便。同時測定了玉米粉樣品中 AFB1的含量,與傳統的高效液相色譜法(HPLC)對照具有高度的一致性,相對誤差在-4.4%～8.4%之間。張弦等[59]利用間接性免疫競爭的原理,利用游離OTA和赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白(OTA-BSA)競爭結合定量的OTA單克隆抗體,研發了一種快速檢測OTA的電化學免疫傳感器。楊弦弦等[60]設計了SWNTs/CS電化學免疫傳感器,可以高效靈敏地檢測玉米樣品中FB1,檢測線性范圍為0.01～1000 ng/mL,檢出限可達2 pg/mL,此外,用該傳感器檢測添加FB1和自然污染的玉米樣品,獲得良好的回收率(96.34%～115.95%)。Li Shi chuan等[61]采用黃曲霉毒素氧化酶(AFO)嵌入在溶膠-凝膠法與多壁碳納米管修飾的鉑電極結合測定AFB1,方法線性范圍為 1～225 ng/mL,檢出限可達 1.6 nmol/mL。Liu Na等[62]研制了一種無標簽的安培免疫傳感器測定ZEN,以聚乙烯亞胺修飾的多壁碳納米管修飾玻碳電極(GCE),用黃金和鉑金納米粒子(AuPtNPs)進行電沉積處理，可以增大抗體捕獲能量提高電化學信號,方法的線性范圍從0.005～50 ng/mL,檢出限達到1.5 pg/mL。

表1 碳納米管電化學特性在真菌毒素檢測中的應用Table 1 Carbon nanotubes-based electric method for detection of mycotoxins

4 展望

近年來,隨著對碳納米材料的不斷探索,其應用越來越廣泛。碳納米材料被應用于樣品前處理方法研究,伴隨其特性不斷被開發和利用,可以給現有真菌毒素檢測技術的發展帶來更多新的方向,其可能的發展趨勢和方向有以下幾個方面:a.經過不同修飾的碳納米管與QuEChERS或SPE相結合,用于多種真菌毒素的聯合測定,隨著前處理方法的不斷更新,兩者的結合必將成為未來分析研究的熱點;b.磁固相萃取技術是21世紀分析領域中用于樣品凈化富集的革命性技術,與傳統SPE技術相比可縮短平衡時間、提高前處理效率,免去過濾、離心等步驟,高度簡化了樣品前處理過程。將碳納米管與磁固相萃取技術相結合應用于不同基質中多種真菌毒素的聯合測定,是分析研究發展的方向之一;c.新材料特性及檢測模式的開發,目前關于碳納米構建電化學傳感器用于真菌毒素檢測已有不少報道,要繼續提高檢測靈敏度和檢測速度,需從研發新材料和新結構方面入手;d.目前,前處理方法在真菌毒素檢測中的應用將朝著開發多種檢測方式和檢測多種毒素的方向發展。

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