基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜用于呼吸道合胞病毒感染細(xì)胞的差異性分析

鄧文嬋

摘 要 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是引起嬰幼兒急性下呼吸道感染及免疫缺陷的常見(jiàn)病原，也是老年、 病弱群體中誘發(fā)免疫抑制的重要病原。本研究利用基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜（MALDIMS），對(duì)RSV 病毒感染宿主細(xì)胞的變化進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在分子量為5000～10000 Da范圍內(nèi)，有3組信號(hào)峰在正常組和感染組中表達(dá)均有顯著變化，其中1個(gè)差異組分在RSV感染之后表達(dá)上調(diào)（m/z 6154.25），2個(gè)差異組分在RSV感染后表達(dá)下調(diào)（m/z 7658.47和9259.82）。本方法無(wú)需對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行復(fù)雜處理，采用MALDIMS證明了感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞前后表達(dá)存在顯著差異，直接獲得細(xì)胞在病毒感染后產(chǎn)生的反應(yīng)應(yīng)答模式和細(xì)胞生理功能改變的信息，為呼吸道合胞病毒疾病診斷與病理研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜； 呼吸道合胞病毒； 疾病標(biāo)志物

1 引 言

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是一種RNA病毒，是引起嬰幼兒急性下呼吸道感染的主要病毒病原，可引起間質(zhì)性肺炎及毛細(xì)支氣管炎[1，2]。其感染在全球范圍都有發(fā)生，且全年均可發(fā)病，對(duì)人類健康影響較大。目前用于RSV病毒研究的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[3]、 直接免疫熒光法[4]、 實(shí)時(shí)PCR技術(shù)及微陣列技術(shù)等[5]，而用質(zhì)譜分析方法研究RSV病毒的報(bào)道還較少。基于蛋白組學(xué)的研究方法，建立快速識(shí)別未感染細(xì)胞與感染細(xì)胞且鑒定表達(dá)差異的有效方法，對(duì)研究RSV病毒病理和細(xì)胞生理功能改變具有重要意義。基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜（Matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDIMS）作為軟電離質(zhì)譜的代表，具有靈敏度高、 分辨率高等優(yōu)勢(shì)，已在蛋白質(zhì)、 多肽、 核酸等生物大分子檢測(cè)尤其是蛋白質(zhì)組學(xué)、 多肽組學(xué)和質(zhì)譜成像分析等研究中得到廣泛應(yīng)用[6～10]。MALDIMS雖然在生物大分子檢測(cè)方面取得了成功，但在單細(xì)胞分析方面仍然有很大的應(yīng)用空間，用于病毒感染細(xì)胞前后生物分子差異表達(dá)分析方面的研究較少。

本研究采用MALDIMS，對(duì)正常細(xì)胞感染RSV病毒后的細(xì)胞組分表達(dá)差異進(jìn)行分析考察。利用MALDIMS高通量、 進(jìn)樣量少及自動(dòng)化程度高的優(yōu)勢(shì)，在不對(duì)細(xì)胞進(jìn)行繁瑣、 耗時(shí)的樣品純化等操作的前提下，初步建立了快速識(shí)別未感染細(xì)胞與病毒感染細(xì)胞的方法。相比于常規(guī)細(xì)胞樣品質(zhì)譜分析需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎及提取物純化等多步繁瑣操作，以及可能會(huì)造成細(xì)胞中微量樣品損失等問(wèn)題，本方法可實(shí)現(xiàn)病毒感染早期細(xì)胞的快速鑒定，可提供RSV病毒病理研究最直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。通過(guò)對(duì)比RSV病毒感染和非感染的Hep2細(xì)胞的質(zhì)譜信號(hào)變化，在排除RSV病毒自身干擾信號(hào)后，明確質(zhì)譜信號(hào)是否來(lái)源于RSV病毒感染Hep2細(xì)胞，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)RSV病毒感染細(xì)胞的快速鑒定， 為呼吸道合胞病毒疾病診斷與病理研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Autoflex Speed基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜（MALDIMS，德國(guó)布魯克公司）； CKX41光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； 5810R高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）； CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（力康生物科技有限公司）； QL901渦旋混勻儀（其林貝爾公司）； 80℃細(xì)胞存儲(chǔ)冰箱（美國(guó)賽默飛公司）。

RSV病毒（廣州博特生物科技有限公司）； Hep2上皮細(xì)胞（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院）； 胰酶、 PBS緩沖液、 RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone）、 胎牛血清（Gibco）、 支原體抗生素Mplasmocin（InvivoGen）、 硫酸鏈霉素、 青霉素G鈉、 戊二醛、 中性紅、 三氟乙酸、 乙腈（美國(guó)SigmaAldrich公司）； α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、 2，5二羥基苯甲酸（DHB）、 芥子酸（SA）（德國(guó)布魯克公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 培養(yǎng)基的配制 取RPMI 1640培養(yǎng)基100 mL，加入10%胎牛血清、 1%雙抗（青霉素G鈉和硫酸鏈霉素）以及0.1% 抗支原體藥，混合配制成10% 細(xì)胞培養(yǎng)基。取 RPMI 1640培養(yǎng)基100 mL，加入2%的胎牛血清以及1%的雙抗，混合配制成2% 細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及病毒擴(kuò)增 Hep2細(xì)胞培養(yǎng)在10% RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃， 5% CO2）培養(yǎng)48 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%以上時(shí)，移去培養(yǎng)基，用5 mL PBS清洗細(xì)胞2次。然后向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入適量RSV病毒，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃， 5% CO2）孵育2 h，吸去RSV病毒廢液，加入13 mL 2% RPMI 1640培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中（37℃， 5% CO2）孵育48 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察出現(xiàn)明顯的合胞時(shí)，收集培養(yǎng)瓶中的溶液至凍存管中， 80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谂囵B(yǎng)瓶中加入2 mL PBS，反復(fù)凍融3次使細(xì)胞裂解，以3000 r/min離心10 min， 收集上清液，即為獲得的RSV病毒，于 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 RSV病毒毒力測(cè)定 用胰酶消化Hep2細(xì)胞，將其用2% RPMI 1640培養(yǎng)液配成一定濃度的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）孵育24 h。然后吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，加入不同濃度梯度的RSV病毒，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37℃，5% CO2）孵育7天。吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，然后每孔加入以戊二醛、 中性紅和PBS配制的混合溶液100 μL，室溫放置1天。吸掉廢液，用清水沖洗各孔，用空斑法計(jì)算所獲得病毒的毒力。endprint

3 結(jié)果與討論

3.1 不同基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響

考慮到在MALDIMS分析中，基質(zhì)有如下作用： 吸收并轉(zhuǎn)移激光能量保護(hù)樣品； 均勻分散樣品避免分析物之間的締合； 提供質(zhì)子使得樣品分子離子化[11]。因此， 應(yīng)首先需確定合適的基質(zhì)。如圖1所示，分別采用α氰基4羥基肉桂酸（CHCA）、 2，5二羥基苯甲酸（DHB）、 芥子酸（SA）基質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CHCA基質(zhì)用于分析檢測(cè)Hep2細(xì)胞，可以得到較為全面的質(zhì)譜信號(hào)，主要原因可能是相比于其它兩種基質(zhì)，CHCA具有更好的激光能量轉(zhuǎn)移及質(zhì)子轉(zhuǎn)移效率。

3.2 不同離子模式的影響

待測(cè)樣品被離子化后，可能攜帶正電荷或負(fù)電荷，因此不同的離子模式對(duì)檢測(cè)效果影響較大[12]。在正離子（LP）模式下，對(duì)于待測(cè)樣品離子化后產(chǎn)生的陽(yáng)離子有較高的靈敏度； 而在負(fù)離子（LN）模式下，主要是對(duì)陰離子有響應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品的靈敏檢測(cè)，對(duì)不同離子模式進(jìn)行了考察。如圖2所示，在負(fù)離子模式下，未檢測(cè)到待測(cè)樣品的任何信號(hào)，但是在正離子模式下，可以明顯檢測(cè)到Hep2細(xì)胞樣品的信號(hào)。這是由于CHCA基質(zhì)分子中羥基、 羧基具有可解離的氫質(zhì)子，在激光的轟擊作用下，解離出的質(zhì)子在飛行過(guò)程中結(jié)合到待測(cè)樣品上，使得待測(cè)樣品分子結(jié)合質(zhì)子帶正電，從而在正離子模式下被檢測(cè)到。所以本研究選用正離子檢測(cè)模式進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 不同激光能量的考察

對(duì)于MALDIMS分析，激光能量的高低直接影響信號(hào)強(qiáng)度的強(qiáng)弱。若激光能量較低，則不利于樣品的離子化，從而檢測(cè)不到樣品信號(hào)； 若激光能量較高，一方面強(qiáng)的激光能量會(huì)破壞待測(cè)樣品，使得質(zhì)譜信號(hào)變得復(fù)雜，進(jìn)而增加分析難度，另一方面強(qiáng)的激光能量會(huì)對(duì)激光器造成損傷，縮減其使用壽命。因此在保證不損傷激光器的前提下，選擇適當(dāng)?shù)募す饽芰繉?duì)樣品解析電離至關(guān)重要。如圖3所示，70%的激光能量時(shí)，得到的信號(hào)強(qiáng)度高，信噪比好，因此本研究選擇70%的激光能量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 RSV病毒感染Hep2細(xì)胞的MALDIMS分析

Calderaro等[13]對(duì)Intestine 407細(xì)胞受RSV病毒感染前后的差異進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)組分有明顯差異表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)RSV病毒的更全面分析，對(duì)RSV病毒感染Hep2細(xì)胞進(jìn)行研究。為了獲得較為準(zhǔn)確的Hep2細(xì)胞受RSV病毒感染前后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，且排除RSV病毒自身信號(hào)干擾，在上述優(yōu)化的條件下，首先對(duì)單獨(dú)RSV病毒的MALDIMS信號(hào)做了考察。如圖4A所示，單獨(dú)RSV病毒的質(zhì)譜信號(hào)主要在m/z 4284.56、 4966.25、 8559.17和11607.49處出現(xiàn)質(zhì)譜峰。繼而通過(guò)MALDIMS質(zhì)譜對(duì)病毒感染前后Hep2細(xì)胞進(jìn)行考察。如圖4B所示，通過(guò)對(duì)Hep2細(xì)胞感染RSV病毒前后的MALDIMS質(zhì)譜圖的比較，發(fā)現(xiàn)在m/z 6154.25、 7658.74及9259.82處質(zhì)譜信號(hào)發(fā)生明顯變化，其中m/z 6154.25的差異組分在RSV感染之后表達(dá)上調(diào)，m/z 7658.47和9259.82的差異組分在RSV感染后表達(dá)下調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道，RSV病毒感染Hep2細(xì)胞后白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素8的表達(dá)存在顯著差異[14]，此外RSV病毒感染所引起的炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)亦與肺泡表面活性物質(zhì)的變化有關(guān)[15]，因此上述結(jié)果在篩選與RSV病毒診斷有關(guān)的生物標(biāo)志物方面具有參考意義，同時(shí)也說(shuō)明病毒感染和致病可能是由病毒因素和宿主細(xì)胞因素兩方面相互作用的結(jié)果。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果還有待深入研究。

4 結(jié) 論

本研究利用MALDIMS高通量、 分析速度快及高靈敏等的優(yōu)勢(shì)，在不對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行純化處理的前提下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)，初步建立了未感染細(xì)胞與RSV病毒感染細(xì)胞的鑒定方法。通過(guò)質(zhì)譜分析技術(shù)，對(duì)正常Hep2細(xì)胞和RSV病毒感染的Hep2細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果表明，被RSV病毒感染后某些組分的表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中組分m/z 6154.25發(fā)生上調(diào)，m/z 7658.74和9259.82發(fā)生下調(diào)。該差異表達(dá)可能來(lái)自兩個(gè)方面，一方面是在病毒感染后，Hep2細(xì)胞自身代謝引起的組分變化，從而有助于Hep2細(xì)胞的進(jìn)一步研究； 另一方面是RSV病毒自身作用引起的組分變化，有助于對(duì)RSV病毒的研究。本研究結(jié)果表明，MALDIMS技術(shù)在呼吸道合胞病毒疾病診斷與病理研究中有良好的應(yīng)用潛能。

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Abstract Respiratory syncytial virus （RSV）， which is a major cause of lower respiratory tract infections during infancy and childhood， is also an important pathogen for immunosuppression in elder and diseased areas. In order to research the pathogenesis of RSV， the matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry （MALDIMS）was used to explore the difference between uninfected cells and virusinfected cells. The result showed that， in the molecular weight range of 5000～10000 Da， there are three component peaks expressed with significant difference in both normal group and infection group. One of the three components was upregulated （m/z 6154.25） and the other two were downregulated （m/z 7658.47 and 9259.82） after RSV infection. This result proved the obvious differences between the infected cells and untreated cells.The differential expression may provide a feasible method for RSV disease diagnosis and pathology research， and also provide scientific evidences for research on development of RSV therapeutic drugs.

Keywords Matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry； Respiratory syncytial virus； Biomarker

（Received 16 June 2017； accepted 12 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21535006）.endprint