地表水中的抗生素質譜指紋提取方法的研究

陳思祎

摘 要 從固相萃取柱、 上樣樣品pH值、 洗脫液、 定容液四方面優化前處理流程，建立了地表水中喹諾酮類、 磺胺類、 四環素類、 大環內酯類、 青霉素類、 頭孢菌素類以及氨基糖苷類7類共49種抗生素的質譜指紋的提取方法。水樣采用MAXHLB 串聯柱富集凈化，在超高效液相色譜串聯質譜（UPLCMS /MS）的多反應監測（MRM）模式下進行定性及定量分析。結果表明，各抗生素在0.001～0.5 μg/mL （鏈霉素為0.01～5 μg/mL）濃度范圍內線性關系良好，各目標抗生素的加標回收率為51.7%～94.8%，相對標準偏差為2.2%～9.7%。 以3倍和10倍信噪比確定目標抗生素在兩種定容液中的檢出限以及定量限分別為0.01～3.23 μg/L和0.05～3.43 μg/L以及0.04～10.8 μg/L和0.17～11.4 μg/L。應用此方法對秦淮河和玄武湖的9個位點進行了抗生素污染篩查。

關鍵詞 固相萃取； 超高效液相色譜串聯質譜； 抗生素； 地表水

1 引 言

近年來，抗生素水環境污染事件頻發 [1]，引起環保部門以及社會各界的關注與重視，而抗生素全國使用量與排放量清單進一步揭示了我國抗生素的使用及污染現狀[2]。目前已在我國多個水系的水體中檢測到抗生素的存在[3]，濃度在ng/L～μg/L范圍[1]。

在實際的地表水抗生素污染監控工作中，樣品量巨大，污染對象也具有很大的不明確性，因此開發快速、 操作簡便以及涵蓋種類更廣泛的抗生素質譜指紋提取方法將大大提高環保部門對水環境抗生素污染定位的能力，可及早發現污染、 追溯污染、 防止進一步造成嚴重的環境危害。所謂指紋，是指能夠全面滿足污染物證分析溯源需要的特征物質信息體系，該體系既要能夠多層面廣尺度展現污染源不同特性及其排它差異，又要能夠通過靈敏快捷、 客觀可靠的現代儀器聯用技術測定[4]，而抗生素質譜指紋則是指通過質譜手段去獲取的水環境抗生素信息。目前已有許多文獻報道通過質譜手段同時檢測多種抗生素的方法[5～8]。徐暉等[9]報道了一種檢測河流水體中痕量的5類 12 種抗生素殘留的固相萃取液相色譜串聯質譜（SPELCMS/MS）方法，并應用該方法分析了河水中的抗生素殘留； Julia等[10]開發了一種能夠長期監測城市污水中醫用抗生素的固相萃取液相色譜串聯質譜（SPELCMS/MS）快速分析方法，該方法可以檢測不同種類共18種抗生素。然而抗生素質譜指紋提取的主要目的是能夠簡便高效地提取多層面廣尺度的抗生素信息，關鍵在于檢測目標物的全面性。但是上述方法涵蓋的抗生素種類有限，并且難以同時對一些理化性質差別巨大的不同類別抗生素進行檢測，無法滿足通過一次提取就能獲得抗生素質譜指紋信息的需求。

本研究從固相萃取柱的選擇、 上樣樣品pH值、 洗脫液、 定容液四方面對前處理流程的進行優化，建立了同時檢測地表水中喹諾酮類（Quinolones， QLs）、 磺胺類（Sulfonamides， SAs）、 四環素類（Tetracyclines， TCs）、 大環內酯類（Macrolides， MLs）、 青霉素類（Penicillins， PENs）、 頭孢菌素類（Cephalosporins， CEPs）以及鏈霉素（Streptomycin， STR）7類共49種抗生素指紋的固相萃取超高效液相色譜串聯質譜（SPEUPLCMS/MS）的分析測定方法。應用本方法對秦淮河和玄武湖共9個位點進行抗生素污染篩查，定位地表水抗生素污染嚴重的異常位點。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配Agilent ECC18色譜柱（75 mm×2.1 mm， 2.7 μm）； SCIEX QTRAP 4500串聯質譜儀（美國AB公司）； AG285電子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）； WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司）； MilliQ超純水儀（美國Millipore公司）； 12通道固相萃取裝置（美國Supelclean公司）。Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、 Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL）、 Waters Oasis MAX固相萃取柱（60 mg，3 mL，30 μm）購于美國Waters公司； CNW BOND SAX（200 mg，6mL，安譜公司）。

抗生素（如表1所示）標準品均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。抗生素內標均購自加拿大Toronto Research Chemicals公司。乙腈、 甲醇和甲酸（色譜純，德國Merck公司）； 乙二胺四乙酸二鈉 （Na2EDTA·2H2O ）、 NaOH（分析純，南京化學試劑有限公司）。

將目標抗生素的標準品分別制成 1000 mg /L 標準儲備液。其中，青霉素類抗生素用乙腈水（1∶1，V/V）配制，磺胺嘧啶和四種喹諾酮類抗生素標準儲備液用1% （V/V）氨水甲醇配制，鏈霉素用20%（V/V）甲醇水溶液配制，其余目標抗生素用甲醇配制。

紅霉素在酸性條件下會發生降解，實驗中通過檢測去水紅霉素來實現對紅霉素的監測。去水紅霉素的配制方法：以30%甲醇溶液配制100 mg/L紅霉素，用3 mol/L H2SO4調至pH 3，在室溫下連續攪動3 h，使紅霉素能完全轉變為去水紅霉素[11]。

2.2 樣品的采集與保存

參照水質河流采樣指導[12]，使用采水器采集采樣點水面下0.5 m處的水樣，每個采樣點采集1 L的水樣，采集到的水樣用0.45 μm孔徑的濾膜過濾后， 于4℃避光儲存，并于一周內分析檢測。endprint

2.3 樣品前處理

取經過濾的水樣1 L，加入0.8 g Na2EDTA和20 μL 內標（10 μg/mL的四環素d6、 磺胺二甲嘧啶d6），用8 mol/L NaOH調節至pH 11。固相萃取柱HLB和MAX分別用6 mL甲醇、 6 mL超純水以及6 mL pH=11的超純水活化。將兩種固相萃取柱以MAX在上、 HLB在下的形式串聯在一起，上樣時水樣先通過MAX柱再通過HLB柱。上樣結束后，用6 mL 5%（V/V）氨水溶液淋洗MAX柱，用6 mL超純水淋洗HLB柱，干燥。

MAX柱先用4.5 mL的溶液Ⅰ（甲酸（pH=3）甲醇（1∶9， V/V））溶液洗脫，并定容至5 mL，渦旋混合后過0.22 μm有機相濾膜，置于進樣小瓶中，待分析檢測。再用3 mL的甲醇和4 mL的2%甲酸甲醇溶液對MAX柱進行洗脫，洗脫液置于20 mL具塞比色管中。HLB柱用6 mL甲醇分3次洗脫，洗脫液置于同一比色管中。洗脫液在40℃下氮吹至完全干燥，用溶液Ⅱ（乙腈水（1∶9， V/V））定容至2 mL，渦旋2～3 min，18000 r/min離心10 min。取上清液過0.22 μm有機相濾膜，取其中1 mL加入甲酸至甲酸含量為0.2%，余下部分不添加甲酸，兩份溶液待測。樣品前處理流程如圖1所示。

2.4 UPLCMS/MS條件

2.4.1 UPLC測定條件 柱溫： 30℃， 流動相： 0.2%（V/V）甲酸/水（A）和乙腈（B），流速0.4 mL/min； 梯度洗脫程序： 0～7.00 min， 90%～60% A； 7.00～10.00 min， 60%～40% A； 10.00～10.01 min， 40%～90% A； 10.01～11.50 min， 90% A。

2.4.2 MS/MS條件 采用電噴霧離子源正電離模式（ESI+），多反應監測模式（MRM）。氣簾氣（Curtain gas，CUR）壓力為35.0 kPa，噴霧氣（Ion source gas 1，GS1）壓力為55.0 kPa，輔助加熱氣（Ion source gas 2，GS2）壓力為60.0 kPa，源溫度（Temperature，TEM）為450.0℃，離子化電壓（Ionspray Voltage， IS）為4500 V，碰撞氣（Collision gas，CAD）參數為 Medium。其它參數如表1所示。

2.5 分析方法的質量控制

為保證實驗結果的可靠性，實驗中采用全程空白、 平行樣及內標對分析過程進行質量控制，并采用標準添加法以降低基質效應的影響。本研究中，磺胺類抗生素以磺胺二甲嘧啶d6（SMTd6） 內標定量，四環素類抗生素以四環素d6（TCd6）內標定量； 其余抗生素，保留時間在2.5 min之前的以磺胺二甲嘧啶d6（SMTd6） 內標定量，在2.5 min后的以四環素d6（TCd6）內標定量。分別將2.3節中得到的3種水樣提取液平均分成兩份，一份直接進樣分析，記錄待測樣品和內標的峰面積； 另一份根據第一份的檢出情況，精密加入適量各目標物標準混合工作液，然后進樣分析，記錄待測樣品和內標的峰面積。依據如下的標準添加法校正公式計算樣品濃度：

C=SRxRs-Rx（1）

其中，C為校正后的濃度； S為標準添加量； RX為標準液添加前測得待測樣品與內標峰面積比值； RS為標準液添加后測得待測樣品與內標峰面積比值[13]。

3 結果與討論

3.1 固相萃取柱的選擇與串聯

抗生素的凈化富集多采用固相萃取的方法。比較了5種不同類型的固相萃取柱（反相吸附型HLB柱、 混合型陰離子交換型MAX柱、 混合型陽離子交換型MCX柱、 弱陽離子交換型WCX柱、 強陰離子交換型SAX柱）對目標抗生素的吸附效果（圖2）。結果表明，大多數抗生素在使用MAX柱萃取時效果較好，回收率在60.2%～101.4%之間，但對磺胺類抗生素的富集效果不佳，這可能由于MAX柱一般在堿性條件下使用，此時兩性的抗生素分子的羧基或者酚羥基等失去氫離子形成的陰離子可以與填料上的季銨陽離子結合，而磺胺類抗生素分子沒有類似結構。相反，在酸性條件下使用MCX柱時，磺胺類抗生素結構中的氨基結合氫離子，形成陽離子，可與填料上的磺酸基陰離子結合，達到較好的富集效果。但MCX柱對喹諾酮類、 四環素類及鏈霉素3類抗生素富集效果極差，回收率低于40%。磺胺類和大環內酯類藥物通過分子間作用力在HLB柱上有較好的富集效果。因此，考慮將MAX與HLB柱串聯使用。

3.2 固相萃取的上樣條件選擇

HLB柱通常在酸性條件下使用，而MAX柱則多在堿性條件下上樣，兩者串聯使用時需要將上樣條件統一。綜合考慮HLB柱和MAX柱的上樣條件，選擇MAX柱上樣pH=3～4，HLB柱上樣pH=8～9進行實驗。

上樣時的pH值與水樣中抗生素的電離情況密切相關，在酸性上樣條件下，兩性分子多以陽離子的形式存在，在MAX柱上難以發生陰離子交換，因此對大多數的抗生素的萃取效果都不理想（圖3），回收率均在20%以下。而HLB柱主要的作用原理是反相吸附，pH值對其的影響小于MAX柱，實驗得到的回收率也相對較好，喹諾酮類、 大環內酯類及青霉素類的回收率在53.9%～81.1%，而回收率較低的磺胺類、 四環素類等目標物在兩種柱子串聯使用時回收率為52.2%～75.5%。綜上，選擇在堿性上樣的條件下將MAX柱與HLB柱串聯使用。

3.3 洗脫條件的選擇

由于各類抗生素之間有較大的性質差異，單純使用有機溶劑洗脫可能得不到較好的洗脫效果，實驗中分別使用水系及有機系洗脫液對HLB和MAX柱進行洗脫（圖4）。其中，水系洗脫液A（Eluent A）為甲酸（pH=3）甲醇（9∶1， V/V）混合溶液； 有機系洗脫液B（Eluent B）為甲醇（HLBB）及甲醇和甲酸甲醇（2∶98， V/V）（MAXB）。endprint

結果表明，磺胺類、 四環素類、 大環內酯類和青霉素類抗生素在HLB和MAX柱使用有機系的洗脫液時有較好的洗脫效果，喹諾酮和頭孢類則在HLB柱使用有機系洗脫液洗脫時效果較好。MAX柱使用水系洗脫劑洗脫時相比HLB柱有較好的效果。鏈霉素在對兩種柱子使用水系洗脫液時有較好的洗脫效果，并且MAX 柱的回收率（41.6%）大于HLB柱（15.6%）。綜合考慮上述實驗結果，采用對HLB柱使用甲醇洗脫，MAX柱用兩種洗脫液分別洗脫以獲得最佳實驗結果。

3.4 定容液的比較

氮吹后使用定容液對殘留物進行溶解定容，比較了兩種定容液對實驗結果的影響。

定容液A （Redissolve solution A）為乙腈0.2%甲酸溶液（1∶1， V/V）； 定容液B（Redissolve solution B）為乙腈0.2%甲酸溶液（1∶9， V/V）。結果如圖5所示，使用定容液B的效果要優于A，尤其是四環素類抗生素，回收率明顯增加。這是由于與定容液A相比，B的有機相比例較低，溶劑的極性較大，對一些極性較大的目標抗生素的溶解能力有所增加。

但是使用定容液B時也發現，青霉素類抗生素容易在檢測譜圖中出現雙峰，不利于定量計算。這是由于青霉素類抗生素在酸性溶液中不穩定，易發生水解，生成青霉噻唑酸，例如芐青霉素（青霉素G）酸性條件下會發生降解，而 pH=5～9 時較為穩定[15]。采用定容液乙腈水（1∶9， V/V）時可以使譜圖呈現單峰，故選擇乙腈水（1∶9， V/V）作為定容液。將得到的樣品分為兩份，一部分以乙腈水（1∶9， V/V）作為定容液，檢測青霉素； 另一部分以乙腈02%甲酸（1∶9， V/V）為定容液，檢測其它抗生素。

3.5 方法學確證

3.5.1 線性范圍及檢出限 用各目標物的標準溶液配制系列濃度梯度（0.001～0.500 μg/mL，鏈霉素為0.01～5.00 μg/mL）的溶液，在上述UPLCMS/MS條件下進行檢測，分別以3和10倍信噪比確定檢出限和定量限（表2）。各目標物在此濃度范圍內具有較好的線性關系，相關系數（R2）在0.9775～0.9994之間。

3.5.2 加標回收率 使用空白水樣在兩個添加水平（10和2 μg/L，鏈霉素為100和20 μg/L）下進行加標回收實驗，結果表明，各目標抗生素的在兩個濃度下的加標回收率為51.7%～94.8%，相對標準偏差（RSD）為2.2%～9.7%（表2）。目標物的質譜指紋圖譜如圖6所示。

3.6 實際樣品檢測

采用上述方法測定秦淮河（Q1～Q5）和玄武湖（X1～X4）的9個水樣，檢測結果如表3所示，樣品中共檢出15種抗生素，包括喹諾酮類、 磺胺類、 四環素類、 大環內酯類以及頭孢類5類，抗生素含量分別為0.3～250.8 ng/L和1.3～210.2 ng/L。

其中，四環素類抗生素檢出濃度最高，為70.6～250.8 ng/L，與Zou等[16]報道的檢出濃度相近。四環素類抗生素多用于畜禽養殖。Zhang等[2]的調查研究顯示，2013年在4種四環素類抗生素用量中，人用占24.8%，獸用占75.2%。四環素類抗生素也是江蘇養殖場的常用藥物，在動物糞便中有高的檢出濃度和檢出率[17]。因此，畜禽養殖污染可能是水樣中四環素類抗生素的重要來源之一。

檢出率較高的抗生素有林可霉素、 克林霉素、 紅霉素以及頭孢拉定，這4種抗生素最大濃度在25.3～0.3 ng/L之間。抗生素的高檢出率可能與其使用量高或者生物降解性低等因素有關。頭孢類抗生素是國內外臨床應用最多的一類抗感染藥物[18]，紅霉素在養殖業以及疾病治療中也有廣泛應用。而林可霉素和克林霉素則由于具有胺、 環結構，脂族醚和硫結構，生物降解性低[19]，易殘留在環境中。

Q3和X4位點的抗生素污染情況與其它位點有明顯的差異，超過10種抗生素被檢出，檢出濃度高達540.8和412.7 ng/L。這一情況可能與位點附近存在抗生素的污染源有關，也可能與采樣前的排污行為有關，因此需要對這兩個位點進行密切監控。

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Abstract An extract method for the fingerprint feature of 49 kinds of antibiotics belonging to multiple classes in surface water was developed. Water sample was purified and concentrated by tandem dual column （MAX and HLB）， and qualitatively and quantitatively analyzed by ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometric （SPEUPLCMS/MS） under multiple reaction monitoring （MRM） mode. The pretreatment was optimized in types of SPE column， loading pH， eluent and redissolution for multiclass antibiotics. The results showed that the linearity of target antibiotics was good in the range of 0.001-0.5 μg/mL （0.01-5 μg/mL for streptomycin）. The recoveries were from 51.7% to 94.8%， and the relative standard deviations （RSDs） ranged from 2.19% to 9.67%. The limits of detection （LOD， S/N=3） were 0.01-3.23 μg/L and 0.05-3.43 μg/L and the limits of quantification （LOQ， S/N=10） were 0.04-10.8 μg/L and 0.17-11.4 μg/L in different redissolve solutions. This method was applied to the determination of antibiotics in water samples from 9 sites of Qinhuai River and Xuanwu Lake.

Keywords Solid phase extraction； Ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Antibiotic； Surface water

（Received 11 May 2017； accepted 1 November 2017）endprint