基于聚合酶輔助信號放大的電化學(xué)發(fā)光DNA傳感器研究

張蒙

摘 要 構(gòu)建一種新型基于聚合酶輔助電致化學(xué)發(fā)光DNA傳感器，利用循環(huán)鏈置換聚合反應(yīng)、 輔助目標mRNA循環(huán)以及量子點的信號放大，實現(xiàn)超靈敏檢測目標mRNA。將巰基修飾的發(fā)卡型捕獲探針（Capture DNA，CP）通過AuS鍵組裝到Fe3O4@Au表面，并通過磁性組裝到磁控玻碳電極上。目標mRNA存在時，目標mRNA打開發(fā)卡CP，與之雜交形成dsDNA； 然后加入聚合酶、 引物鏈（DNA1）及堿基，引物鏈開始擴增，將目標mRNA取代，釋放的目標mRNA重新結(jié)合CP，引發(fā)下一輪擴增循環(huán)，使信號循環(huán)放大，最后加入TGACdTe量子點標記的DNA2，與打開后的CP末端序列通過堿基互補配對結(jié)合，進行電化學(xué)發(fā)光檢測。在1×10 15～1×10 11 mol/L范圍內(nèi)，目標mRNA濃度的對數(shù)與ECL信號呈良好的線性關(guān)系，檢出限為3.4 × 10 16 mol/L。人體血清樣加標回收率為97.2%～102.3%。本方法通過加入聚合酶使目標mRNA循環(huán)檢測以及結(jié)合量子點標記的信號放大協(xié)同提高了檢測的靈敏度。結(jié)果表明，此傳感器具有良好的選擇性、 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

關(guān)鍵詞 DNA傳感器； 聚合酶； 目標物循環(huán)； 信號放大； 電化學(xué)發(fā)光

1 引 言

近年來，由于環(huán)境污染以及日常生活中不良習(xí)慣的影響，癌癥的發(fā)病率逐漸增高，嚴重危害人類健康[1]。早期診斷是提高癌癥患者治愈率和生存率的關(guān)鍵[2]。研究發(fā)現(xiàn)，mRNA 表達與多種類型的腫瘤密切相關(guān)，不僅可以作為診斷的生物標志物，也可以作為潛在的治療靶點[3，4]。因此對癌癥mRNA的檢測分析已經(jīng)成為目前臨床診斷和疾病治療的重要參考和依據(jù)。

目前檢測mRNA有多種方法。RNA印記法[5]是傳統(tǒng)的mRNA分析方法，但是耗時長、 靈敏度低、 過程繁瑣。為了克服這些缺點，研究者開發(fā)了許多新方法，包括微陣列分析[6，7]、 熒光法[8]、 PTPCR[9]、 等溫指數(shù)放大法[10]、 分子信標法[11]等。然而，這些方法分析成本較高、 操作程序復(fù)雜，靈敏度仍需進一步提高。相比之下，電化學(xué)傳感器作為選擇性好、 成本低、 準確度高、 快速簡便的檢測手段已成為目前mRNA檢測的研究熱點之一[12，13]。

在利用DNA電化學(xué)傳感器進行檢測時，為提高靈敏度，常采用擴增放大目標物和增強檢測信號等方法。前者如聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）[14]、 依賴核酸序列的擴增技術(shù)（NASBA）[15]等。通過目標物擴增的信號放大技術(shù)是目前提高檢測靈敏度常采用的方法[16～20]。而采用DNA“三明治”雜交結(jié)構(gòu)[21]和量子點[22，23]等為典型的增強檢測信號放大策略。

電化學(xué)發(fā)光由于具有靈敏度高，特異性好，發(fā)光易于控制等優(yōu)點，已經(jīng)成為臨床診斷中最有前景的方法之一。量子點因其高效及穩(wěn)定的電化學(xué)發(fā)光性能被作為發(fā)光標記物廣泛用于電化學(xué)發(fā)光分析中。本研究引入酶放大技術(shù)[24～27]， 利用DNA聚合酶的擴增反應(yīng)引導(dǎo)目標物循環(huán)輔助信號放大，并結(jié)合量子點增強電化學(xué)發(fā)光信號，實現(xiàn)了對目標物的高靈敏檢測，建立了一種基于聚合酶電化學(xué)發(fā)光DNA傳感器檢測mRNA的新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MPIE型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限公司）； PGSTAT128N Autolab電化學(xué)工作站（瑞士萬通有限公司）； AL204型電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司）； 磁控玻碳電極（d=3 mm）； CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）。

1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺（EDC）、 N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、 巰基己醇（MCH）， 均購自浙江普康化工有限公司。K3Fe（CN）6、 NaOH、 NaCl、 KCl、 CdCl2·2.5H2O、 K2S2O8、 Na2HPO4·12H2O、 NaH2PO4·2H2O，均購自西隴化工股份有限公司。三（2羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）、 巰基乙酸（TGA），均購自上海安妍生物有限公司。FeSO4·7H2O、 FeCl3·6H2O，購自鄭州四季化工產(chǎn)品有限公司。碲粉（Te）、 硼氫化鈉（NaBH4）、 氯金酸（HAuCl4）、 檸檬酸鈉，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。0.2 mol/L PBS緩沖液（pH=7.4）。所用試劑均為分析純，溶液均用二次蒸餾水配制。堿基序列、 Klenow Fragment聚合酶、 酶反應(yīng)緩沖液和脫氧核糖核酸混合液（dNTP Mix），均購于上海生工生物工程公司。所使用的堿基序列如表1所示。

2.2 實驗方法

2.2.1 核殼型磁性納米粒子Fe3O4@Au的制備 Fe3O4@Au納米微粒的合成參照文獻[28＼]的方法并稍作改進。稱取0.67 g FeSO4·7H2O和1.14 g FeCl3·6H2O，用水溶解并定容至250 mL。將溶解后的混合溶液倒入通有氮氣的三口燒瓶內(nèi)（始終通氮氣保護），在50℃水浴中，迅速加入2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液至pH≈10，期間不斷攪拌并持續(xù)通氮氣1.5 h。將溫度調(diào)至80℃，每隔5 min測量pH值，確保溶液中的pH值穩(wěn)定，加熱熟化磁性納米粒子25 min。冷卻至室溫，通過磁鐵進行磁性分離，每隔30 min用二次蒸餾水洗滌一次，直到溶液呈中性，配成5 mg/L Fe3O4溶液，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

稱取0.229 g檸檬酸鈉溶解在100 mL水中，倒入三口燒瓶并在機械攪拌下加熱至99℃，迅速加入1 mL 上述制備的磁性Fe3O4納米粒子和1 mL 1 g/mL HAuCl4溶液，恒溫攪拌15 min。移去熱源，繼續(xù)攪拌15 min，得到酒紅色溶液，冷卻至室溫后，通過磁鐵進行磁性分離。用水洗滌至溶液為中性，并用水定容至20 mL，得到0.25 mg/L Fe3O4@Au貯備液， 4℃保存?zhèn)溆谩ndprint

2.2.2 水溶性CdTe量子點的制備 參照文獻[29＼]中TGACdTe量子點合成方法，稍作改進。準確移取4 mL水于100 mL 三頸瓶中，通入氮氣除氧10 min，加入0.360 g NaBH4和0.144 g Te粉，在65℃水浴下磁力攪拌反應(yīng)20 min，直至黑色Te粉完全消失，得到紫色透明0.2 mol/L NaHTe溶液。

配制250 mL 0.0025 mol/L CdCl2溶液，加入到500 mL三口圓底燒瓶中，通氮氣除氧15 min，加入100 μL巰基乙酸，用NaOH調(diào)至pH≈10。繼續(xù)通氮氣除氧10 min并持續(xù)強磁力攪拌。加入上述制備的0.2 mol/L NaHTe溶液，95℃下攪拌回流2 h，即得到酒紅色透明的CdTe量子點溶液， 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 傳感器制備 取0.1 mL 1 μmol/L捕獲探針DNA （CP）與40 μL 10 mmol/L TCEP混合孵育1 h， 進行CP巰基的活化。將上述活化的CP與1 mL Fe3O4@Au溶液混合，37℃孵育12 h，CP通過AuS鍵自組裝在磁性納米粒子表面。然后將100 μL 1 mmol/L巰基己醇溶液加入上述溶液中，避光孵育1 h， 5000 r/min 離心10 min，棄上清液，沉淀重懸于PBS緩沖液中，即得Fe3O4@Au/capture DNA溶液。將處理好的電極浸泡在含有10 μL Fe3O4@Au/capture DNA溶液和20 μL 0.2 mol/L PBS緩沖溶液中，37℃孵育12 h。將電極浸入1 mmol/L巰基己醇（MCH）中37℃孵育1 h，以封閉電極上殘留的空白結(jié)合位點。分別用PBS緩沖液和水各清洗3次。再加入不同濃度目標mRNA，37℃孵育1 h。在目標mRNA存在時，CP與mRNA兩條鏈進行互補雜交，發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開。用PBS緩沖液和二次蒸餾水各清洗3次。將上述電極置于20 μL酶反應(yīng)緩沖液、 10 μL DNA 100 Klenow片段和2 μL 50 μmol/L dNTP的混合溶液中，37℃孵育3 h。引物（DNA1）與位于發(fā)夾暴露的頸部底端的互補序列雜交，加入聚合酶和堿基后，引物鏈開始擴增，將目標mRNA替換取代，mRNA可重新打開另一個發(fā)夾，形成一個循環(huán)。

3.2 修飾電極循環(huán)伏安法表征

圖4是不同電極修飾過程循環(huán)伏安掃描圖， a是裸電極的循環(huán)伏安圖，b是自組裝DNA（CP）后的Fe3O4@Au電極循環(huán)伏安曲線。 由于CP修飾在電極上，與曲線a相比，曲線b電流減弱。這是由于固定在電極表面的DNA的磷酸骨架降低了電極表面電子傳遞速率。加入目標mRNA后（圖4曲線c），電極表面磷酸骨架增多導(dǎo)致電極表面的負電荷增多，相比b曲線電流明顯下降。加入聚合酶、 堿基以及酶反應(yīng)緩沖液后，引物從5'端向3'端延升，將目標mRNA取代，替換下的mRNA又進一步打開另一個發(fā)卡（CP），引起另一個鏈替代反應(yīng)，因此電流明顯減小（圖4曲線d）。

當目標mRNA雜交后，又進一步阻礙電子傳遞，電極表面電子傳遞阻抗進一步增大（圖5d）。當加入聚合酶后，形成的新鏈將目標mRNA替代，目標循環(huán)利用，形成的新鏈增長，阻抗也相應(yīng)增大（圖5e）。最后加入量子點標記的DNA （圖5f），表面電荷進一步增加，與（圖5e）相比，電子傳遞阻抗明顯增大。

3.4 實驗條件優(yōu)化

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了基于聚合酶輔助放大的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器，用于癌癥標記物mRNA檢測。通過聚合酶聚合對目標物循環(huán)放大，并結(jié)合量子點，實現(xiàn)了多重信號放大，提高了傳感器檢測靈敏度。本研究建立的放大技術(shù)為癌癥標記基因的早期診斷提供了參考。

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Abstract A novel polymerasebased electrochemiluminescence DNA sensor was constructed for messenger RNA （mRNA） detection by cyclic chain displacement polymerization， assisted by target mRNA cycle， and quantum dots signal amplification. Firstly， the mercaptomodified capturetype capture DNA （CP） was immobilized on the surface of a magnetocontrolled glassy carbon electrode via AuS bond. After adding the target mRNA， CP was opened and hybridized with mRNA to form dsDNA. After adding polymerase， primer chain （DNA1） and the base， the primer chain was extended to replace the target mRNA. After one cycle， the mRNA chain could open another hairpin in order to carry out next cycle of amplification. Finally， electrochemical luminescence detection was carried out by adding DNA2 labeled TGACdTe quantum dots. The amplification of the target mRNA by the addition of polymerase and the signal combined with the quantum dot mark improved the sensitivity of the sensor greatly. The result showed that the logarithm of target mRNA concentration had a good linear relationship with the corresponding ECL signal in the range of 1 × 1015-1 × 10 11 mol/L， with the detection limit of 3.4 × 10 16 mol/L（S/N=3）. Under the optimal conditions， the recoveries of mRNA spiked in human serum sample were 97.2%-102.3%. This sensor exhibited good selectivity， stability and reproducibility.

Keywords DNA sensor； Polymerase； Target cycle； Signal amplification； Electrochemical luminescence

（Received 19 June 2017； accepted 10 November 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21375031， 21765006）， the Natural Science Foundation of Guangxi Province， China （No. 2015GXNSFFA139005）， and the High Level Innovation Teams of Guangxi Colleges & Universities and Outstanding Scholars Program of China （Gui Jiao Ren[2014] No. 49）endprint