致孔劑溶解度參數對大孔層析介質的結構影響研究

蘭夢菲

摘 要 分別以甲基丙烯酸縮水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯為功能單體和交聯劑，采用懸浮聚合方法制備了大孔聚合物微球。考察了致孔劑的組成及用量對微球的孔徑、比表面積的影響，其中隨著致孔劑中的良溶劑（二氯甲烷 δ=9.7 （cal/cm3）1/2）和不良溶劑（正辛醇δ=10.3 （cal/cm3）1/2的比例變化，致孔劑體系溶解度參數可調范圍為9.89～10.09 （cal/cm3）1/2），隨著致孔劑與聚合物之間溶解度差值的增加，微球的孔徑隨之增大而比表面積呈下降趨勢。將此類微球偶聯聚乙烯亞胺衍生為陰離子交換層析介質，以前沿分析法比較了不同孔徑的微球的傳質性能，其中孔徑為257 nm的介質仍能保持較高的動態蛋白載量（45.1 mg/mL），表明此類大孔介質在高通量分離純化應用方面具有很大潛力。

關鍵詞 致孔劑； 溶解度參數； 大孔微球； 蛋白質； 分離

1 引 言

人們對生物制品的需求日益增加，促使生物制藥生產規模不斷增加，如何高效地獲得符合要求的生物產品，是下游分離純化技術所面對的挑戰，因此發展高通量的分離分析方法勢在必行。層析分離作為一種主流技術在蛋白分離純化中占有重要地位，其中色譜層析介質是分離柱的核心。當前以瓊脂糖為基質的介質應用廣泛，具有生物相容性好、化學穩定性高等優點，但其缺乏機械剛性、耐壓性差（通常<0.3 MPa）、孔徑小[1]（孔徑范圍在3～50 nm之間），尤其在分離大尺寸生物分子，如病毒、類病毒顆粒時，表現出載量低、通量小的不足。而具有大孔結構的聚合物層析介質機械強度高（可耐受10 MPa以上壓力）、孔徑尺寸大（>100 nm），更適合大尺寸分子的傳質，能夠滿足快速、高通量分離純化的需求，可彌補這些不足[2]。

以瓊脂糖為基質的介質多以懸浮自由基聚合制備而成，控制微球結構從而獲得貫通孔是制備難點。二十世紀九十年代初出現的顆粒內以對流傳質為特征的灌注色譜填料（POROS 系列）[3]，其最大特點為同時具有貫通孔（500～800 nm）和擴散孔（20～100 nm），在保證蛋白分子快速傳質的同時具有較高的蛋白載量。這種介質制備過程中先形成納米粒子，然后粒子間進行團聚從而得到大孔微球，因其制孔過程復雜而難以準確控制[4]。Sun研究組[5，6]采用碳酸鈣顆粒和有機溶劑作為致孔劑制備超大孔PGMA微球，得到具有102 nm孔徑微球，但由于無機顆粒與有機聚合物的相容性較差，所得微球的貫通孔不易均勻控制； Zhou等[7，8]研究了以反膠團溶脹法制備聚丙烯酸酯類和苯乙烯類為基質的超大孔層析介質。以上兩種方法均是通過設計不同的致孔劑，從而制得貫通孔結構。該類大孔聚合物微球對蛋白大分子有著較好的傳質性能，但同時其比表面積會顯著降低，甚至低于10 m2/g，介質的蛋白載量難以提升[9，10]。本課題組前期工作中采用原子轉移自由基聚合方式制備大孔聚丙烯酸酯類微球，具有200～300 nm的貫通孔[11，12]，同時具有較高的比表面積，在調控孔徑及比表面積的過程中發現，致孔劑對于微球結構的影響最為顯著，但對其影響規律未做進一步研究。

本研究仍分別以甲基丙烯酸縮水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯為功能單體和交聯劑，在傳統懸浮聚合體系中，系統研究了致孔劑組成及用量對微球的結構包括孔徑大小、比表面積、表面形貌、蛋白載量等的影響，探索了溶解度參數與微球結構之間的規律關系。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FEI Quanta400F掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）； Autopore IV9500壓汞儀（美國Micromeritics公司），VSorb 2800比表面積測定儀（南京金埃譜公司）； KTA Purifier 10 蛋白層析系統（美國GE公司）。

甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA，純度98%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，純度98%）、聚乙烯醇（PVA，醇解度87%，平均聚合度1700）、聚乙烯亞胺（PEI分子量600）均為試劑純（阿拉丁試劑公司）； 偶氮二異丁腈（AIBN，分析純）、二氯甲烷（DCM，分析純）、正辛醇（OA，分析純）、十二烷基苯磺酸鈉（SDS，純度99%），國藥集團； 牛血清白蛋白（BSA，試劑級，純度>98%，美國SigmaAldrich公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 大孔聚合物微球的制備 介質采用懸浮聚合方法制備，其反應過程如圖1所示，具體實驗步驟如下：（1）配制水相：稱取10 g PVA、1.0 g SDS加入1000 mL去離子水中，水浴加熱至80℃，在磁力攪拌下至完全溶解成透明溶液，冷卻至室溫，備用； （2）配制油相：稱取0.040 g AIBN加入25 mL三角瓶中，然后再依次加入1.0 mL GMA、1.0 mL EDMA、1.5 mL二氯甲烷、1.5 mL正辛醇，在室溫下振蕩15 min混合均勻； （3）在通入氮氣的條件下，將油相緩慢滴入水相中， 200 r/min攪拌，滴加完畢后，升溫至60℃反應8 h，聚合完畢后，將溶液進行抽濾，然后放入索氏提取器，用丙酮抽提24 h，取出在50℃下真空干燥24 h后，室溫下存放，備用。

2.2.2 陰離子交換介質的衍生及離子交換容量的測定 陰離子交換介質的制備過程參照文獻[13]方法： 稱取5.0 g干燥的自制大孔微球（PGMAEDMA）置于250 mL三口瓶中，然后依次加入50 mL二甲基亞砜和5.0 g聚乙烯亞胺，攪拌混合均勻后加熱至60℃，反應24 h，反應完畢后，將溶液抽濾，并用去離子水洗滌至無色，然后放入玻璃層析柱中測定其離子交換容量[14]，其具體操作如下：（1）首先用30 mL 1.0 mol/L NaOH溶液將介質轉型為OH型； （2）將去離子水通入層析柱中，清洗介質至流出液為中性； （3）準確量取50 mL 0.10 mol/L加入層析柱中，并同時收集流出液體； （4）向層析柱中加入30 mL 1.0 mol/L NaCl溶液，將此收集液與步驟（3）的收集液合并； （5）用標準HCl溶液滴定收集液，根據下式計算介質的離子交換容量Q。endprint

2.2.3 前沿分析法測定層析介質的蛋白載量 取1.0 mL PGMAEDMAPEI介質裝入層析柱管（Φ 10 mm×13 mm）中，將此柱子連接于AKTA Purifier 10蛋白層析系統中。以50 mmol/L TrisHCl緩沖溶液（pH=8.0）為平衡液A，以1.0 mol/L NaCl TrisHCl緩沖溶液（pH=8.0）為洗脫液B，并用平衡液A配制 1.0 mg/mL BSA溶液。色譜條件如下：設定操作流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，先平衡層析柱10 mL（即10 柱體積，10CV），然后用泵頭上樣方式開始吸附BSA，100%流穿后再以平衡液A沖洗層析柱至基線，最后以洗脫液B洗脫吸附蛋白，根據流穿體積計算介質動態吸附載量。

3 結果與討論

3.1 致孔劑中兩組分的比例對微球形貌的影響

致孔劑對多孔材料的成孔起著至關重要的作用。首先考察了致孔劑中兩種組分的不同比例組成對微球形貌的影響，固定致孔劑的體積用量，改變兩種組分之間的比例。其中二氯甲烷（DCM，δ=9.7 （cal/cm3）1/2）為良溶劑，正辛醇（OA，δ=10.3 （cal/cm3）1/2）為不良溶劑，PGMAEDMA微球的溶解度參數參照聚甲基丙烯酸甲酯擬定為9.3（cal/cm3）1/2，以上有關溶解度參數均參照文獻[15]的數值，致孔劑二者的體積組成比例分別為2∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2（對應的溶解度參數依次為9.89、10.0、10.06、10.09 （cal/cm3）1/2），不同比例下的表面形貌變化如圖2所示，DCM/OA為2∶1時（A1和A2）微球表面致密，幾乎無孔； 當降低DCM用量，DCM/OA為1∶1時（B1和B2），微球表面開始變得粗糙，放大5000倍下的SEM圖（B2）出現100 nm以內的大孔； 繼續降低DCM用量，二者比例為1∶1.5時（C1和C2），微球表面的孔徑增大至200～300 nm； 隨著DCM用量進一步減少，當下降為DCM/OA=1∶2時（D1和D2），微球表面粗糙度顯著，大孔尺寸及數量均明顯增加，孔之間的通透性增加；繼續減少DCM的用量（DCM/OA=1∶3），微球破碎嚴重。微球的表面形貌分析表明，不良溶劑OA用量的增大對形成大孔有促進作用，而良溶劑DCM有利于微球的成球或者機械強度的提高，此趨勢與普通的多孔聚合物材料制備規律相似[16]。

3.2 致孔劑體系的溶解度參數對微球內部結構的影響

不同比例的致孔劑體系的溶解度參數以及所對應微球的孔徑及比表面積如表1所示。致孔劑體系的溶解度參數由9.89 （Cal/cm3）1/2增加到10.09 （Cal/cm3）1/2所對應的微球孔徑呈增大趨勢，最大平均孔徑可達（257.0±0.2） nm，相反，對應的比表面積為下降趨勢，從（134±1） m2/g下降至（47±1） m2/g。通常認為聚合物的溶解度參數值與溶劑的溶解度參數值越接近時，聚合物越傾向于溶解其中[17]。致孔劑體系與PGMAEDMA微球之間的溶解度差值顯示致孔劑與PGMAEDMA的相容性優劣，進而影響微球的結構有一定影響，其影響見圖3和圖4。由溶解度參數差值Δδ對孔徑的影響趨勢圖（圖3）可見，隨著差值的增加，微球孔徑呈上升趨勢，而其比表面積則相反呈下降趨勢（圖4）。究其原因，溶解度差值Δδ越大，致孔劑與聚合物之間的相容性越差，在聚合過程中生成的聚合物與致孔劑之間的相分離發生的越早，后期聚合物在早期析出的核上繼續生長，形成的聚集顆粒尺寸偏大，聚集顆粒尺寸越大則顆粒間的空隙也隨之增大，因此，最后形成了較大的孔徑。與此同時，聚集顆粒尺寸越大則對應的比表面積則越低，故微球的比表面積變化呈相反趨勢。

3.3 不同結構微球的蛋白動態載量測定

將不同孔徑的微球衍生后制備得到陰離子交換介質（PGMAEDMAPEI），分別測定了其離子交換容量和動態蛋白載量值。從表2可見，隨著介質孔徑的增加（21～257 nm），離子交換容量稍有下降，主要是由于介質的比表面積降低，致使介質表面偶聯PEI配基的量減少，但此影響并不顯著，介質的離子交換容量均保持在0.35 mmol/mL以上。可能是介質的比表面積雖然降低，但相應的孔徑的增加降低了大分子配基PEI的傳質以及反應位阻，故最終對偶聯PEI的數量沒有顯著影響。

比較了不同孔徑結構的PGMAEDMAPEI的動態載量，通常介質孔徑的增大有利于蛋白大分子的傳質，但由于比表面積降低，蛋白載量也會降低，從表2可知，介質的動態載量隨著孔徑的增加呈下降趨勢，從61.4 mg/mL下降至45.1 mg/mL，下降幅度為26.5%，但遠小于比表面積下降幅度（64.9%），表明此類大孔介質一定程度上能夠保持較高載量。

4 結 論

本研究采用懸浮聚合方法制備了甲基丙烯酸縮水甘油酯與乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚的大孔微球，考察了致孔劑的溶解度參數對微球結構的影響。結果表明，隨著致孔劑中不良溶劑比例的增大，微球的孔徑隨之增加，同時比表面積呈現下降趨勢。致孔劑體系與聚合物之間的溶解度參數差值越小，微球的孔徑越小， 比表面積越大，相應的蛋白載量越高。本研究為聚合物層析介質的制備提供了參考。

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Abstract The macroporous microspheres were prepared through suspension polymerization and based on a copolymer of glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate. The effect of porogen on the microspheres structure was evaluated in terms of pore size and surface area. Porogen contained dichloromethane （δ=9.7 （cal/cm3）1/2） and Noctanol （δ=10.3 （cal/cm3）1/2） which corresponded to a good and poor solvent， respectively. The solubility parameter of porogen was controlled in the range of 9.89-10.09 （cal/cm3）1/2. The pore size of microspheres increased with the difference value of solubility parameter between the polymer and the porogen. On the contrary， the surface area of microspheres decreased in this study. The anion exchange media was prepared through coupling poly（ethylene imine） in the microspheres， and the proteins transport was determined by frontal analysis method. The macroporous microspheres with 257 nm pore size could still afford a high proteins capacity （45.1 mg/mL）. These macroporous supports showed a large potential in a rapid separation of proteins.

Keywords Porogen； Solubility parameter； Macroporous microspheres； Protein； Separation

（Received 7 October 2017； accepted 21 November 2017）

This work was supported by Beijing Natural Science Foundation， China （No. 2162013）.endprint