一種帶磁力攪拌的免疫散射比濁儀的設計

楊延麗，潘 峰

(1. 廈門安防科技職業學院 福建廈門361026；2. 桂林長海發展有限責任公司 廣西桂林541001)

0 引 言

C反應蛋白(CRP)是一種急性時相反應蛋白，在急性和慢性感染、創傷、腫瘤、心肌梗塞時其血濃度急劇升高，檢測 CRP對臨床診斷有重要的參考價值[1]。目前我國臨床試驗測定 CRP特定蛋白的方法主要有兩種，透射比濁法和散射比濁法。在大型全自動生化分析儀器中常用的是透射比濁法，但是生化儀受其方法學的制約只能檢測到分子量大的蛋白，如免疫球蛋白和白蛋白。而臨床上需要了解的恰恰是分子量精確到 ng/mL或 pg/mL級別的蛋白含量。對于門診臨床快速診斷的要求而言，研制便攜式、小體積、快速檢測的特定蛋白免疫檢測儀器是非常必要的。這種專門的特定蛋白儀采用免疫散射比濁法，它可以將靈敏度提高到 ng/mL級別，從而增加了很多具有獨特臨床價值的蛋白檢測項目。

此外，為了適應門診臨床診斷的簡便、快速檢測需求，最新的CPR試劑通常采用全血進行測試，省去了血清分離的處理過程，這對分析儀提出了更高的要求。為了適應這種需求，本設計研制的特定蛋白分析儀器采用免疫比濁檢測方法，利用自動化的攪拌功能，將病人全血與試劑充分混合，使免疫反應中抗體抗原的結合更加充分。本儀器是一種將液相內的沉淀反應、現代光學檢測技術和自動分析技術相結合的特定蛋白分析儀器，不僅可以檢驗 CRP，也可以測量免疫球蛋白、糖化血紅蛋白等。

1 總體設計方案

根據免疫散射比濁檢測法原理，結合特定蛋白檢測試劑，針對全血檢驗的需求，本儀器總體框圖如圖 1所示。儀器由嵌入式處理器、光學裝置、硅光電二極管、放大電路、A/D轉換電路、恒溫裝置、比色杯檢測傳感器、試劑IC卡讀卡器、微型打印機、USB接口、帶觸摸屏的顯示模塊、電源等模塊組成。

圖1 儀器總體框圖Fig.1 Block diagram of the instrument

根據本儀器所使用的試劑特性，其主要的散射光是前向散射，故本儀器采集前向角為15～25 °的前向散射光，采用兩級透鏡將搜集到的散射光聚焦，最后將光線投射到硅光電二極管上。光路設計如圖 2所示。

圖2 光路設計示意圖Fig.2 Schematic of optical path design

2 比濁儀硬件設計

為了使儀器獲得較高的靈敏度和效率，光源與光電轉換器件的響應頻譜范圍做良好的匹配是很重要的。根據試劑顆粒的尺寸，本儀器選用 LD紅光點狀激光器作為光源，激光器輸出波長為 650,nm，最小光斑直徑為φ0.3,mm，輸出功率為 200,mW，光束發散度小，具備一致性好、穩定可靠性高的優點。光電轉換傳感器采用日本濱松的硅光電二極管 BPW69A，感光面積 5.8,mm×5.8,mm，峰值波長 660,nm，光譜響應范圍 190～1,050,nm，較低的暗電流(小于200,pA)，較高的響應速度，較高的穩定性。

在比色杯孔底座下，各設計一套恒溫裝置，包括PTC加熱片，DS18B20數字溫度傳感器，儀器開機后嵌入式處理器控制電路開啟加熱片加熱，由DS18B20實時檢測溫度，使溫度保持在接近人體溫度的 35～37,℃范圍內，用于給比色杯內的反應液加溫。

在儀器的兩個比色杯位置下面，各設計了一套直流電機+磁鐵裝置，當傳感器檢測到有比色杯插入測試孔時，自動啟動磁力控制電機，儀器嵌入式處理器控制電磁鐵轉動，帶動比色杯內的攪拌子快速攪拌反應液，促進全血中特定蛋白與試劑的免疫反應。

高靈敏度的硅光電二極管將接收到的散射光轉換成電流信號，再由OPA121運放對電流信號進行放大，放大后的信號送入A/D轉換芯片ADS1253轉換成數字信號后，由嵌入式處理器接收并存儲。

嵌入式處理器選用成熟的 ARM32芯片STM32F407，用于儀器的多任務處理：檢測比色杯插入取出狀態、控制恒溫裝置、控制磁力攪拌裝置、控制LED光源、讀取A/D轉換數據、與試劑管理IC卡通信、接收觸摸屏信息、控制顯示屏模組、與 PC通信、將相關信息和結果保存打印等。

3 比濁儀軟件設計

儀器的軟件設計包括嵌入式處理器內的軟件和上位機 PC軟件。嵌入式處理器軟件實現整機管理，采用 freeRTOS嵌入式操作系統管理所有任務，相對于單片機系統而言，該軟件系統效率高，能夠有序處理彩色液晶屏幕刷新、觸摸屏輸入、恒溫控制、磁力攪拌、試劑 IC卡管理、與 PC通訊、打印輸出等任務。上位機 PC的軟件主要完成曲線擬合、與醫院管理系統聯機、臨床檢驗相關數據管理等功能。其中比較重要的部分是利用測試得到的吸光值，去計算被測反應液中待測物含量的功能。

在免疫比濁法的抗原和抗體結合的過程中，吸光度與濃度之間不呈線性關系，通常情況是三次方程曲線關系。免疫比濁法在實際操作中，根據所用的終點法或速率法，用五點或七點不同濃度進行定標，經過三次曲線方程擬合求出一條能真實反映實際濃度與吸光度關系的曲線方程，作為定量的工作曲線。如果采用以往單一標準濃度單點定標方法，以及采用兩點定標方法，誤差較大，尤其是高值濃度范圍內，測定結果與實際偏差太大。所以簡單地采用線性擬合的方式處理免疫比濁數據，只能適用于濃度很低的情況。如果采用五點定標的方式，使用 logit-log函數擬合曲線[2]，擬合曲線的精度用相關系數(或稱決定系數)R2的大小來判定[3]，只要相關指數 R2的值控制在0.99以上，則可以得到精確的擬合度、較高的準確性和較小的誤差。

為了去除干擾信號以及本底的影響，本儀器測試前先用空比色杯測試一次光值，然后以實際測試比色杯反應液的光值減去空杯光值的方法扣除本底。在測試比色杯反應液光值時，每隔 10,s測試一次數值，一共測試12次，然后將12次數據求平均值，提高測試結果的準確性。因為被測物含量與反應液中抗體抗原結合物濃度有關，結合物的濃度與硅光電二極管所測得的散射光強度有關，本儀器將硅光電二極管測得電流轉換成電壓，經過高性能運動放大轉換成數字信號后，儀器將該信號傳送到PC機，PC機根據五點定標 logit-log函數計算出參數，用確定參數的logistic4P方程計算待測物的濃度。PC機將待測物濃度數據回傳給儀器的嵌入式處理器，再結合所用試劑類型、試劑批號、測試時間等信息，生成免疫比濁檢驗報告，通過微型熱敏打印機打印出來作為診斷依據。

為了檢驗本儀器測試特定蛋白指標的準確性，將一組 10個已知濃度的測試液(3.01,μg/mL、3.23,μg/mL、6.57,μg/mL、8.73,μg/mL、16.79,μg/mL、18.39,μg/mL、 46.83,μg/mL、 57.09,μg/mL、130.76,μg/mL、141.18,μg/mL)分別使用本儀器和全自動生化儀測試。測試結果表明，本儀器測試光值再通過擬合曲線計算出的濃度數據，誤差都在該測試液允許的范圍內，但是總體誤差比全自動生化儀大，特別是低端的 3個濃度的測試液，用本儀器無法區分。但是從醫院門診做初步判斷需要快速出結果的要求角度而言，本儀器能夠在10,min內給出檢驗結果，相比生化儀需要隔天甚至幾天出結果，檢驗速度上明顯優于生化儀。

4 結 論

設計本儀器的主要目的是為了滿足快速檢驗的需求，在采樣現場即刻進行分析，省去標本在實驗室檢驗時的復雜處理程序，快速得到檢驗結果。本儀器主要適用于新型的使用全血進行 C反應蛋白的免疫檢驗要求，設計了磁力攪拌、帶觸摸屏的液晶屏、微型打印機等適應快速出結果的檢驗要求的功能模塊。為了達到檢驗性能指標的要求，采用了與上位機PC聯機進行精確的曲線擬合計算，從而達到在測量范圍內 10個濃度測試液誤差都在允許范圍內的指標，滿足了快速檢驗的需求。■

［1］王慧，羅煒，陳濤. 免疫透射比濁法CPR檢測試劑盒的性能評價[J]. 中國熱帶醫學，2006，6(8)：1479-1480.

［2］張弢，許培仁，雷素萍. 膠乳增強免疫比濁實驗中標準曲線的模式[J]. 第四軍醫大學學報，2005(3)：392.

［3］周記薌. 實用回歸分析方法[M]. 上海：上海科學技術出版社，1990：48-50.