八仙花葉柄離體培養和植株再生技術研究

楊寶明 ，蘇 艷 ，黃玉玲 ，李永平 ，張藝萍 ，桂 敏 ，王麗花

（1.云南省農業科學院農業環境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農業科學院花卉研究所，農業部花卉產品質量監督檢驗測試中心（昆明），國家觀賞園藝工程技術研究中心，云南 昆明 650205）

八仙花（Hydrangea macrophylla）又名繡球花、紫陽花，為虎耳草科八仙花屬植物。花大而美，花序呈球形，開花時節，花團錦簇，其花色能紅能藍，令人悅目怡神，是常見的盆栽觀賞花木，也是主要的鮮切花。八仙花原產我國四川和日本，在亞洲主要是日本盛產，主要作為家庭盆栽觀賞。其花色隨土壤pH的變化而變化，在花蕾期施用硫酸鋁可使花顏色形成藍色，施用石灰可使花保持粉紅色[1]。我國栽培八仙花的時間較早，在明、清時代建造的江南園林中就栽有八仙花，現代公園和風景區都成片種植，已形成景觀[2-3]。八鮮花傳統的繁殖方法為扦插、分株和壓條等，繁殖速度慢，不能滿足市場對種苗的需求，而植物組培技術可在短時間內建立無性繁殖體系，不受外界條件和季節影響，生長周期短，可控性強，可實現周年生產，能穩定地為市場提供性狀穩定、品質統一的優良種苗[4-9]。有關八仙花組織培養的研究報道較多，但大部分都以莖段[5-18]、莖尖[19]或葉片[20]為繁殖材料，而以葉柄作為外植體的研究報道[21]很少。

本試驗以八仙花葉柄為繁殖材料，通過分析比較不同激素濃度配比對外植體愈傷組織誘導、分化以及植株再生的影響，以篩選適宜的愈傷組織誘導培養基、不定芽增殖培養基和生根培養基，旨在為八仙花的組織培養提供一種新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

取八仙花植物當年生枝條上的中部和上部葉柄（包括葉片）作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌 在自來水下將外植體沖冼干凈，用0.2%的高錳酸鉀溶液浸泡15 min，用自來水沖洗干凈，剪去葉片，留下葉柄。在超凈工作臺上先用75%的酒精浸泡20 s，再用0.1%的升汞滅菌12 min，然后用無菌水沖洗5～6次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分。

1.2.2 愈傷組織的誘導培養 經滅菌的葉柄，用手術刀切長為0.5 cm左右的小塊，接種于1～16號處理的培養基中，平放置于培養基表面，30 d后統計出愈率及生長情況，并進行轉接。每個處理接種10瓶，每瓶接種1塊外植體，重復3次。

1.2.3 不定芽的分化培養 經愈傷組織誘導培養獲得的愈傷組織，切割成0.5 cm×0.5 cm的方塊，接種于17～24號處理的培養基中，20 d后統計不定芽分化率、芽叢數量和生長情況。每個處理接種10瓶，每瓶接種1塊愈傷組織，重復3次。

1.2.4 增殖培養 經不定芽誘導培養獲得的小苗或者芽叢，分割為含1～2個莖節的莖段或含有2～3個小芽的芽叢，轉接到25～28號處理的培養基中，15 d后統計芽增殖率及生長情況。每15 d為一個轉接周期。每處理接種5瓶，每瓶接種6個莖段或芽叢，重復3次。

1.2.5 生根培養 經增殖培養獲得的小苗，切成高度為2～3 cm的植株，接種于29～33號處理的培養基中，15 d后統計生根情況。每處理接種5瓶，每瓶接種10株，重復3次。

1.2.6 培養條件 以上培養基均為MS，蔗糖30 g/L，瓊脂5.0 g/L，pH值為5.8～6.0，光照強度為1 600～2 000 lx，培養室溫度為（25±2）℃。

1.3 測定項目及方法

計算愈傷組織誘導率、不定芽分化率、芽增殖率和生根率。

愈傷組織誘導率＝產生愈傷組織的外植體數/接種外植體數×100%；不定芽分化率＝產生芽的愈傷組織塊數/接種愈傷組織塊數×100%；芽增殖率＝不定芽產生的數量/接種芽數×100%；生根率＝生根苗數/接種苗數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同濃度細胞分裂素6-BA與不同濃度生長素NAA，2，4-D配比對不同部位葉柄愈傷組織誘導的影響

表1 不同濃度激素配比對愈傷組織誘導的影響

從表1可以看出，將上部和中部葉柄分別接種到1～16號培養基中，都能產生愈傷組織，且中部葉柄比上部葉柄愈傷組織誘導率高，誘導效果以14～16號處理較好，在16號培養基中愈傷組織出現最早、生長速度最快，誘導率最高，上部葉柄和中部葉柄的誘導率分別達56.6%和90%，但愈傷組織結構疏松；其次為15號培養基，上部葉柄和中部葉柄的誘導率分別為56.6%和86.6%，愈傷組織結構松緊適中。2，4-D的誘導效果要好于NAA，誘導效果隨2，4-D，NAA濃度的增加而增加，其中，在含有2，4-D的培養基中，葉柄接種15d左右切口開始膨大，20 d左右形成明顯的愈傷組織細胞團（1 cm×1 cm）；含有NAA的培養基中，葉柄接種20 d左右切口才開始膨大，25 d左右才有愈傷組織形成，生長緩慢，30 d愈傷組織誘導情況如圖1所示。

2.2 不同濃度細胞分裂素6-BA與不同濃度生長素NAA配比對不定芽分化的影響

由表2可知，在愈傷組織不定芽的分化培養過程中，17～24號處理均能分化不定芽，但不同的處理對不定芽的分化、芽的數量和生長影響不同。隨著細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度的增加，不定芽的分化效果明顯增強。6-BA為1.5 mg/L，NAA為0.2 mg/L時，分化效果最好，分化率達到90%，芽粗壯、整齊、疏密適中；6-BA為2.0 mg/L，NAA為0.2 mg/L時，不定芽分化較早，但芽點密集、芽伸長不明顯、整齊性差，不利于下一步的增殖培養。因此，應以23號處理為好，即MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA0.2 mg/L。不定芽的增殖培養情況圖2所示。

表2 不同濃度6-BA與NAA配比對愈傷組織不定芽分化的影響

2.3 不同濃度6-BA與不同濃度NAA配比對增殖培養的影響

由表3可知，25～28號處理均能實現芽的增殖，平均增殖芽2.03～7.03個，其中，28號處理芽的增殖數量最高、芽點最多，但芽密集、纖弱；26，27號處理芽的數量較28號處理少，但芽粗壯、整齊、葉片開展，更有利于下一步的生根壯苗培養。因此26，27號處理更有利于芽的增殖培養。

表3 不同濃度6-BA與NAA配比對芽增殖的影響

2.4 NAA和IBA對生根的影響

從表4可以看出，接種在33號培養基上的小苗，生根效果最好，其生根率達90.66%，平均根數達6.45條；其次為31號培養基，生根率達89.33%，平均根數為5.61條（圖3為25 d生根培養，圖4為生根苗生長情況）。

表4 不同濃度激素處理對生根的影響

3 結論與討論

應用組培快繁技術是獲得性狀統一、穩定、優質的八仙花種苗最為有效的途徑之一。葉柄可以誘導出完整植株，當以葉柄作外植體時，中部葉片葉柄的誘導效果明顯好于上部葉片葉柄。因為上部葉片葉柄因組織幼嫩，在滅菌過程中，損傷大，容易造成部分組織死亡或褐化，影響了誘導效果。

本研究結果表明，在相同濃度的6-BA條件下，2，4-D，NAA 都能誘導出愈傷組織，2，4-D 對愈傷組織的誘導效果明顯好于NAA，其可提前5～10 d產生愈傷組織、愈傷組織生長速度快。但2，4-D濃度過高，易造成愈傷組織結構疏松，不利于不定芽的誘導[4]。適宜愈傷組織誘導的最佳培養基為MS＋6-BA2.5 mg/L＋2，4-D0.2 mg/L。

本研究中，適合不定芽誘導的最佳培養基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，誘導率為90%，誘導效果好，易形成不定芽。適合不定芽增殖的最佳培養基為MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA0.2 mg/L，平均增殖芽5.45個，芽粗壯、整齊、成苗高。適合生根的最佳培養基為MS＋IBA0.6 mg/L＋NAA0.4 mg/L，其次為MS＋NAA 0.8 mg/L。IBA和NAA組合使用的生根效果好于單用NAA的效果，根系粗細適中、柔軟，不易折斷；NAA單獨使用時，生根時間短，但根系粗而脆，出瓶時易折斷。

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