桿狀病毒AcMNPV中Ac109蛋白的抗蟲功能分析

許書美，付月君

（山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006）

桿狀病毒屬于環狀雙鏈超螺旋DNA病毒,有囊膜包被，呈桿狀形態，不同病毒的基因組大小為80～180kbp。其宿主昆蟲主要是鱗翅目、膜翅目及雙翅目昆蟲。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是首先完成基因組測序的桿狀病毒，基因組大小為133 890 bp，有156個開放閱讀框[1-3]。在所有桿狀病毒的生活史中均包含2種病毒粒子形態：出芽型病毒粒子BVs和包埋型病毒粒子ODVs，其中，BVs主要介導細胞與細胞間的感染，ODVs主要介導蟲體與蟲體間的感染[4]。甜菜夜蛾（Spodoptera exiguaHubner）隸屬于鱗翅目夜蛾科，是一種世界性分布、間歇性大發生的以危害蔬菜為主的雜食性害蟲。

AcMNPV基因組包含ac109基因，推測這個基因與子代病毒的增殖有關。ac109屬于桿狀病毒AcMNPV的156個開放性閱讀框之一，ac109為逆時針方向編碼的基因，在AcMNPV基因組的逆轉錄編碼序列的38 002～39 174 nt位置，全長1 173 bp，編碼390個氨基酸的多肽，有且僅擁有一個典型的晚期或極晚期啟動子元件（GTAAG），序列具有高度保守性[5]。蛋白質保守結構域預測表明，390個氨基酸都與未知功能病毒蛋白質家族DUF673有很高的同源性，而這個家族并未在相關文獻中報道[6]。在所有目前提交已測序的53株桿狀病毒的全基因組序列中，有52種桿狀病毒全基因組都具有ac109的同源物。有研究證明，ac109核心基因是桿狀病毒核衣殼正常組裝過程中所必需的基因，表達產物為病毒粒子結構蛋白，該蛋白對于病毒在細胞間的傳播至關重要。它的缺失不影響病毒DNA的復制，但能夠影響病毒正常的轉運以及影響BV進入細胞核[7]。

本研究為進一步明確在病毒感染宿主昆蟲過程中Ac109蛋白的功能，采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統[8-10]構建了重組的桿狀病毒AcMNPVAc109-EGFP，并檢測了AcMNPV-Ac109-EGFP對甜菜夜蛾幼蟲的抗蟲效率，旨在為研發和應用高抗蟲活性的重組病毒殺蟲劑提供了試驗依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試草地貪夜蛾卵母細胞株Sf9由山西大學細胞分子生物學課題組保存并培養；AcMNPV、大腸桿菌DH10 Bac菌株和pFastBac Dual-egfp由山西大學細胞分子生物學實驗室保存。受試蟲為甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hubner），蟲卵購自河南省濟源白云實業有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內切酶Sam I，Xho I和T4 DNA連接酶從寶生物（大連）技術公司購買；抗體anti-β-actin和anti-GFP從上海生工生物工程有限公司購買；細胞裂解液和BCA蛋白分析試劑購自碧云天生物技術公司（江蘇）；所有的化學藥品都是分析級別，購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP的構建 為構建重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP，首先構建了重組中間載體pFastbacdual-Ac109-EGFP。首先，從AcMNPV的基因組中擴增ac109基因片段，PCR引物序列為 ac109-Sma I-F（5′-ACCCGGGATGGAGT GCCCGTTT-3′，劃線部分表示SamI位點）和ac109-Xho I-R：（3′-CCGCTCGAGCCAAATAATAGTTGTA C-5′，劃線部分表示Xho I位點）。PCR反應產物被克隆到pFastBac Dual-EGFP載體的Sam I位點與Xho I位點中間。構建好的中間載體經測序證明構建成功。將構建好的中間載體pFastBac Dual-Ac109-EGFP轉化進Escherichia coli strain DH10 Bac（DH10B），與 AcMNPV 基因進行轉座重組。通過特異引物M13-F（5′-CGCCAGGGTTTTCC CAGTCACGAC-3′）和 M13-R（5′-CACACAGGAAA CAGCTATGAC-3′）進行PCR鑒定，確定重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP是否構建成功（圖1-A）。

1.3.2 重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP的構建將生長狀態良好的（對數生長期的）Sf9細胞均勻鋪入96孔板中，待細胞長至80%后，將重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP（0.2 μg）和脂質體轉染試劑liposome TransFastTMTransfection Reagent（0.6 μL）（美國Promega公司）混勻后，轉染Sf9細胞。轉染24 h后，用熒光顯微鏡檢測Ac109-EGFP的表達，轉染3～4 d后收集上清液，即為第1代重組病毒。然后，再用第1代病毒液侵染新鋪板的Sf9細胞，3～4 d后再次收集上清液，即為第2代重組病毒，依次類推，獲得了第3代重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP（熒光顯微鏡觀察如圖1-B所示）。第3代重組病毒即可用于后期活性檢測試驗。

1.3.3 蝕斑試驗 將生長狀態良好的Sf9細胞均勻鋪入6孔細胞培養板中，待細胞匯合度達到80%后，分別用不同稀釋度的1 mL病毒液AcMNPVAc109-EGFP侵染Sf9細胞2 h，然后移去病毒液，并用PBS清洗，加入1.8%的營養瓊脂，待其凝固后倒置。感染4～5 d后，用熒光顯微鏡檢測并統計AcMNPV-Ac109-EGFP處理組細胞形成的綠色熒光斑。根據綠色熒光斑數計算得出具有侵染活性的芽生型病毒滴度。

病毒滴度（pfu/mL）＝最高稀釋倍數的蝕斑數×最高稀釋倍數×接種病毒量（mL/孔） （1）

感染復數（multiplicity of infection，MOI）＝病毒滴度（pfu/mL）×接種病毒量（mL）/感染細胞總數（2）

1.3.4 Western blot免疫印跡分析與熒光顯微鏡觀察 將生長狀態良好的Sf9細胞按6×106個/孔鋪入6孔板中，然后用5 MOI（multiplicity of infection，感染復數）的AcMNPV-Ac109-EGFP分別侵染12～72 h，熒光顯微鏡觀察Ac109-EGFP的表達情況。同時，Western blot定量分析Ac109-EGFP的表達量。收集侵染的細胞、裂解液裂解細胞，并收集蛋白樣，再通過BCA蛋白分析試劑測定總蛋白樣品濃度。然后，經SDS-PAGE電泳，再將目標蛋白轉入PVDF膜上。PVDF膜經5%的脫脂奶粉封閉液封閉1h后，4℃過夜孵育一抗（anti-β-actin和anti-GFP），之后用PBST清洗4次，每次15 min，然后再次孵育熒光二抗（IRDye680LT）1h，然后PBST再清洗4次，每次15 min。最終將PVDF膜置于ODSSY CLx中檢測。一抗anti-β-actin和anti-GFP均按1∶2 000稀釋，二抗IRDye 680LT（Li-COR有限公司，美國）按 1∶20 000 稀釋[11-12]。

1.3.5 抗蟲活性分析 采用人工飼喂病毒法經口感染甜菜夜蛾幼蟲，檢測重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP對宿主甜菜夜蛾的致死作用。幼蟲孵化后即移入裝有27 mm3小塊人工飼料的12孔板內，每孔1頭，成長為2齡幼蟲即可用于試驗。試驗設置了1個PBS緩沖液對照組和2個病毒處理組（AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Ac109-EGFP），每組60頭幼蟲。待蟲體成長為二齡幼蟲時，每天將20 μL1×107pfu/mL的2種病毒分別滴加到試驗組培養基上，連續滴加5d。對照組滴加PBS緩沖液，然后逐天記錄蟲體的質量，并統計死亡率、蛹化率及羽化率。

1.4 數據分析

每個試驗都進行3個獨立試驗，使用Excel進行t檢驗，評估其統計學意義（P＜0.05為顯著，P＜0.01或P＜0.001為極顯著）。

2 結果與分析

2.1 Western blot免疫印跡和熒光顯微鏡檢測Sf9細胞內Ac109的表達量

熒光顯微鏡觀察結果表明，在試驗時間段內，隨著AcMNPV-Ac109-EGFP侵染時間的延長，熒光強度顯著增加，侵染72 h時侵染率達到最高（圖2-A）；Western blot免疫印跡結果如圖2-B所示，其中，融合蛋白Ac109-EGFP的大小為69 ku，β-actin的大小為42 ku，與免疫印跡條帶大小一致，這進一步驗證了我們的構建是成功的。這一結果同樣表明，隨著時間增加，Ac109的表達量顯著增加，在侵染后的72 h時，Ac109-EGFP表達量增大。

2.2 重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP抗蟲活性分析

由圖3可知，2組病毒處理組中的甜菜夜蛾幼蟲與PBS對照組相比生長緩慢，并且有低的蛹化率和羽化率以及高的致死率，說明該類病毒對甜菜夜蛾幼蟲有較強的致敏性。如圖3-A所示，2組病毒處理組的幼蟲質量均低于PBS處理組的蟲體質量，其中，重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP處理組中蟲體質量又略低于AcMNPV處理組；如圖3-D所示，AcMNPV與重組病毒處理組AcMNPV-Ac109-EGFP的甜菜夜蛾的半致死時間（LT50）分別為20，16 d，說明重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP與AcMNPV相比，影響了蟲體生長，且對甜菜夜蛾有更快的致死效果。

蛹化率也是檢測抗蟲效率的一個重要標志。AcMNPV與AcMNPV-Ac109-EGFP病毒處理組的蛹化率分別為41.67%與25.00%（圖3-B），羽化率分別為20.00%和11.67%（圖3-C）。這些結果都表明，過表達ac109使得重組病毒AcMNPV-Ac109- EGFP具有更高的抗蟲效應。

3 結論與討論

本試驗結果證實，過表達Ac109蛋白的重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP的抗蟲效率相較于野生型桿狀病毒更強。ac109基因是一種結構基因，是桿狀病毒科中31個核心基因之一，是病毒復制的必需基因[13]。桿狀病毒核心基因對它的生命活動有重要影響，它們對病毒DNA復制、基因轉錄和核衣殼組裝等過程有關鍵作用。理論上，侵染性BV產量越高將導致越高的細胞毒性，進而產生高的殺蟲效率。用重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP經口服感染甜菜夜蛾幼蟲，幼蟲致死率明顯高于AcMNPV的致死率，病毒處理的幼蟲體質量均低于PBS處理組的幼蟲體質量，且化蛹率和羽化率也明顯低于對照組病毒及PBS處理組，說明重組病毒AcMNPVAc109-EGFP在進入幼蟲體內提高了子代侵染性病毒BV增殖率，從而使其在蟲體細胞內產生更高的毒性。先前研究結果表明，AcMNPVac109核心基因編碼晚期結構蛋白，是桿狀病毒核衣殼正常組裝過程中所必需的基因，表達產物為病毒粒子結構蛋白，該蛋白對于病毒在細胞間的傳播至關重要[14]。ac109基因的缺失不影響病毒DNA的復制，但是會影響病毒正常的轉運以及影響BV進入細胞核[15]。因此認為，過表達Ac109可以增強桿狀病毒的轉運以及加快出芽型病毒BV進入細胞核的過程，從而使子代病毒增殖加快，進而導致更高的殺蟲效率。

本研究結果明確了Ac109對宿主昆蟲的殺蟲效率，為揭示AcMNPV的抗蟲機制和本文構建的重組病毒潛在的抗蟲應用價值提供了試驗依據。過表達ac109基因的病毒可提高桿狀病毒的殺蟲效率，因此，可單獨或聯合其他抗蟲基因（重組形成多價病毒）作為重組微生物殺蟲劑。同時，ac109基因是病毒自身基因，因此，從生物安全性方面考慮是安全的。

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