FSH和LH及其受體基因在梅山豬公豬HPT軸的表達

產舒恒，陳子璇，張戌園，陳 青，王宵燕

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

動物體內的促性腺激素包括垂體前葉分泌的卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)、胎盤分泌的孕馬血清促性腺激素和絨毛膜促性腺激素以及垂體前葉和胎盤分泌的促乳素。其中，FSH、LH及其相關基因是動物生長發育過程中重要的生理功能基因。在雄性動物中，FSH促進睪丸足細胞合成和分泌雄激素，刺激生精上皮的發育和精子發生(在次級精母細胞及其以前的階段，FSH起重要作用，此后由睪酮起主要作用)。LH刺激睪丸間質細胞合成和分泌睪酮，促進副性腺的發育和精子最后成熟[1]。

FSH是一種糖蛋白激素，分子是由非共價鍵結合的α和β 2個亞單位組成的異質二聚體。在同一物種中，α亞基是一致的，而β亞基是特異性的[2]。一般認為α亞基負責信號的轉化作用，β亞基是功能亞基[3]，參與受體的結合。現在認為，α、β亞基均參加受體的結合與信號的轉導作用。LH也是一種糖蛋白激素，它的分子結構與FSH的分子結構相似，由α和β 2個亞單位組成，α亞基為促性腺激素所共有，β亞基具有激素和種間特異性，是激素的特異性亞基單位，能與靶器官受體結合。目前，對FSH-β亞基和LH-β亞基的研究較多，如趙要風等對豬FSH-β亞基基因的研究表明，FSHβ基因在幾個豬品種之間存在多態性，而且是作為一種促進卵泡發育和成熟的糖蛋白激素，高排卵數豬品種二花臉、梅山豬與其他低排卵數品種表現出對應的差異[3]。對于FSH和LH的作用，傳統觀點認為FSH、LH只對性腺有作用，但是近年來的研究發現，在性腺外的組織上也存在這2種激素受體，王亞男對京海黃雞FSHβ和FSHR基因的表達規律的研究結果顯示，FSHR基因在脾臟中的表達量僅次于性腺[4]，說明FSH、LH在性腺外組織中也可能起作用，李波等對母豬性腺外FSH受體和LH受體表達的研究也證明了這一點[5]。關于FSH和LH在動物體中的發育性表達研究進展迅速，倪迎冬等研究了出雛至性成熟紹鴨卵巢FSHR和LHR表達的變化，結果顯示卵巢FSHR mRNA水平呈先升后降趨勢，LHR mRNA水平的變化，總體呈逐漸升高趨勢[6]。郝建明等論證了垂體前葉存在著LH、FSH、LH-FSH等3種促性腺激素細胞，為進一步探討FSH、LH分泌及基因表達與調控，揭示生殖生理規律提供了新的資料和思路[7]。近年來，基因工程重組FSH和LH的研究逐步發展，使人們可根據一些特殊需求改造天然FSH和LH的結構和功能，使之具有更高的活性、更穩定的結構，以滿足畜牧生產和醫學應用的需要。同時，也為其他糖蛋白激素基因工程制劑的研制生產提供借鑒[8]。

本試驗采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法和熒光定量(PCR)方法分析FSH和LH在梅山豬公豬腦組織、生殖組織和內臟組織中的表達特征及表達規律，確定FSH和LH在不同發育階段中的表達量以及它們在細胞中的定位，這將有助于更好地了解它們在精子發生過程中的作用和對睪丸功能的調節。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗動物梅山豬由江蘇省蘇太豬育種中心提供。取6頭150日齡的梅山豬公豬睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾、精囊腺、前列腺、尿道球腺、大腦、小腦、下丘腦、垂體、海馬、心、肝、脾、肺、胃及肌肉等組織用于表達譜分析。將2(n=6)、30(n=6)、60(n=5)、90(n=5)和150日齡(n=6)的梅山豬在屠宰后取下丘腦、垂體、右側睪丸用于基因的發育性表達研究。

1.2 試劑與儀器

試劑：液氮、TRIzol[寶生物工程(大連)有限公司]、三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇、DEPC水(Fermentas)、超純水、Oligo(dT)18(Fermentas)、5×反應緩沖液(Fermentas)、Ribonuclease Inhibitor(Fermentas，20 U/μL)、dNTP(Fermentas 10 mmol/L)、M-MuLV Reverse Transcriptase(Fermentas，200 U/μL)、10×buffer[寶生物工程(大連)有限公司]、4×dNTP[寶生物工程(大連)有限公司，2.5 mmol/L]、Taq酶[寶生物工程(大連)有限公司，5 U/μL]、引物(上海英維捷基生物工程有限公司)、瓊脂糖(MBI Fermentas)、5×TAE水、Marker(TaKaRa公司)、熒光定量試劑盒。

試驗器材：研缽、研磨棒、勻漿器、4 ℃離心機、指形管、紫外分光光度儀、PCR管、水浴鍋、普通離心機、超凈工作臺、PCR儀、烘箱、電泳儀和紫外成像儀、熒光定量PCR儀。

1.3 組織樣品RNA的提取與反轉錄

1.3.1 樣品RNA的提取與濃度測定 采用酚-三氯甲烷-異戊醇的方法提取組織RNA。提取的RNA用一定量的DNAase(RNAase free)消化，測D260 nm/280 nm，采用電泳法檢測RNA純度。嚴格定量后，取5 μg組織總RNA利用反轉錄酶進行反轉錄合成cDNA。

1.3.2 反轉錄與半定量檢測目的基因的表達 取RNA樣品5 μg，按照試劑盒的要求進行反轉錄，引物序列等信息見表1。目標基因PCR體系(25 μL)：超純水17.3 μL；10×buffer 2.5 μL；4×dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL；rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL；上游引物(F端)1 μL；下游引物(R端)1 μL；模板DNA 1 μL。目標基因PCR程序：預變性94 ℃ 4 min；真變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，循環數為35次。瓊脂糖電泳檢測并拍照分析。

表1 檢測目標基因表達情況所用引物序列等信息

1.4 熒光定量

以2、30、60、90及150日齡梅山豬下丘腦、垂體和睪丸為模板研究FSH和LH發育性表達變化。20 μL反應體系：Mixture 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA樣品 50 ng，加水至20 μL。樣品在96孔板混勻后放入ABI7500熒光定量PCR儀上進行反應，每個樣本設3個重復。反應程序參照SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa)說明書。

定量PCR的數據采用2-ΔΔCT分析。CT值由ABI7500的軟件自動分析。以β-actin為內參，150日齡組作對照，ΔΔCT=(CT目的基因-CT管家基因)1、30、60、90日齡組-(CT目的基因-CT管家基因)150日齡組。2-ΔΔCT表示2、30、60、90日齡組目的基因的表達量相對于150日齡的變化倍數。

1.5 數據統計

應用SPSS 13.0統計軟件中的單因素方差分析對FSH、LH及其受體在不同日齡的公豬HPT軸相關組織中的表達進行差異比較。

2 結果與分析

2.1 FSH和LH及其受體在公豬腦組織、生殖組織和內臟組織中的表達特征

2.1.1 FSH及其受體在公豬腦組織、生殖組織和內臟組織中的表達特征 由圖1可見，FSHβ基因只在梅山豬公豬的下丘腦和垂體中表達，在垂體中表達豐度較高，在下丘腦中較低；FSHR基因在梅山豬公豬的睪丸、在附體、附尾和尿道球腺中表達，在睪丸中表達豐度較低，在附體、附尾和尿道球腺中的表達豐度基本一致。

2.1.2 LH及其受體在公豬腦組織、生殖組織和內臟組織中的表達特征LHβ基因在梅山豬公豬的睪丸、附頭、附體、垂體、大腦、小腦和海馬中表達，在小腦中的表達豐度較低；LHR基因在梅山豬公豬的睪丸和下丘腦中表達，表達豐度基本相同(圖2)。

2.2 FSH和LH及其受體在不同日齡的公豬HPT軸相關組織中的表達

2.2.1 FSH及其受體在下丘腦、垂體和睪丸中的相對表達量 由表2可知，FSHβ在下丘腦和垂體中的相對表達量在一定范圍內隨日齡的增加而增加，90日齡表達量開始上升，150日齡達到表達高峰，FSHβ在下丘腦中的表達量在前4個日齡段中無顯著差異，150日齡的表達量與前4個日齡段存在顯著差異(P<0.05)，FSHβ在垂體中的表達量在90日齡時顯著高于前3個日齡段，而150日齡的表達量與前4個日齡段有顯著差異(P<0.05)；FSHR在睪丸中的相對表達量在前3個日齡段中較穩定，90日齡時表達量開始降低，150日齡達到最低值，90日齡、150日齡與前3個日齡段相比存在顯著差異(P<0.05)。

2.2.2 LH及其受體在下丘腦、垂體和睪丸中的相對表達量 由表3可知，LHβ在垂體中的表達、LHR在下丘腦中的表達和LHR在睪丸組織中的表達趨勢相同，呈現波動起伏狀態，30日齡出現表達高峰，60日齡表達量降低，90日齡時再次達到表達高峰后又降低，并且30、90日齡的表達量與其余3個日齡段的表達量多數呈現顯著差異(P<0.05)；LHβ在睪丸中的表達量在前3個日齡段無顯著差異(P<0.05)，90日齡時達到表達量最高峰，其表達量與其他4個日齡段呈現顯著差異(P<0.05)，150日齡時表達量有所降低。

表2 FSHβ及其受體在下丘腦、垂體和睪丸中的相對表達量

注：同一行含不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

表3 LH及其受體在垂體、下丘腦和睪丸中的相對表達量

3 討論

3.1 FSH和LH在公豬各個組織中的表達特征

一直以來，人們普遍認為FSHR、LHR僅存在于特異的性腺的靶器官和組織中，近年來研究發現，FSHR、LHR可存在于性腺外組織[9]。本試驗結果顯示，FSHβ、LHβ和LHR在腦組織中有表達，說明FSH和LH及其受體并不是特異性地表達在性腺組織中，根據本試驗結果，筆者推測腦組織參與和調控性激素的合成和代謝過程，FSH、LH也可能對腦組織的某些功能起調節作用。此外，FSHβ在下丘腦和垂體中均有表達，但在垂體中的表達量高于下丘腦中的，可能因為FSHβ在垂體中的調節作用大于在下丘腦中的調節作用。精子細胞是在睪丸中生成，在附睪中發育成熟的[10]。FSHR在睪丸和附睪中均有表達，但在睪丸中的表達量比較低，說明FSH結合FSHR可能在精子發生和成熟方面都有調控作用，但其對精子發育具有主要調控作用；LHβ在睪丸和附睪中的表達量基本相同，則其可能在精子發生和發育過程中都發揮重要作用；LHR只在睪丸中表達，那么它可能對精子發生過程起重要的調控作用。有研究表明，FSH對雄性動物可刺激精子的發生，它能刺激曲細精管上皮和次級精母細胞的發育，在LH和雄激素的協同下使精子發育成熟。但是如果只增加FSH的量，雖能使睪丸增大、曲細精管上皮細胞分裂活動增加、精子細胞增多，但并無成熟精子形成[11]。這一研究結果為本試驗的推測提供了重要依據。

3.2 FSH和LH在各日齡的下丘腦、垂體和睪丸中的表達規律

陳雪雁等研究FSH和LH在不同發育階段(4、6、9周)大鼠睪丸中的表達，結果顯示在mRNA水平，在不同發育階段中FSH的表達無明顯差別，而LH只在6周和9周的大鼠中有表達[12]。位蘭等研究黃體生成素在不同日齡(1、30、90日齡)雛鴕鳥睪丸內的分布發現，1 d鴕鳥睪丸內有分布，但在30 d睪丸內未檢測到；LH在90 d鴕鳥睪丸內有分布，但其陽性表達較弱[13]。Grzegorzewska等在雞胚發育的第11天和第17天的FSH和LH表達研究中發現，在不同性別中FSH和LH的表達具有明顯差異[14]。上述幾項研究只選取了2個或3個發育階段，而本試驗選取了梅山豬生長過程的5個日齡段(2、30、60、90、150日齡)。從試驗結果來看，FSHβ在下丘腦和垂體中的表達量總體呈現上升的趨勢，90日齡的表達量迅速升高，150日齡最高；LHβ在垂體中的表達、LHR在下丘腦中的表達和LHR在睪丸組織中的表達趨勢相同，呈現波動起伏狀態，30日齡出現第1次表達高峰，90日齡時又達到第2次表達高峰，出現這種情況的原因可能與梅山豬公豬在30日齡開始精子發生過程和60～90日齡間到達初情期密切相關；FSHR在睪丸中的表達量與LHβ在睪丸中的表達量都呈現先升高后降低的趨勢，不同的是在FSHR在30日齡時表達量最高，LHβ在90日齡時表達量最高，而30日齡是精原干細胞啟動精子發生的時期，60～90日齡是公豬的初情期啟動階段，這一試驗結果證實公豬體內促性腺激素對精子發生和初情期的啟動具有調控作用。

4 結論

4.1 FSH和LH在公豬各個組織中的表達特征

FSHβ基因在梅山豬公豬的下丘腦和垂體中表達，FSHR基因在梅山豬公豬的睪丸、附體、附尾和尿道球腺中表達，LHβ基因在梅山豬公豬的睪丸、附頭、附體、垂體、大腦、小腦和海馬中表達，LHR基因在梅山豬公豬的睪丸和下丘腦中表達。

4.2 FSH和LH在各日齡的下丘腦、垂體和睪丸中的表達規律

FSHβ在下丘腦和垂體中的表達總體呈現上升的趨勢，LHβ在垂體中的表達、LHR在下丘腦中的表達和LHR在睪丸組織中的表達趨勢相同，呈現波動起伏狀態，30日齡出現第1次表達高峰，90日齡時又達到第2次表達高峰，FSHR在睪丸中的表達與LHβ在睪丸中的表達都呈現先升高后降低的趨勢。

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