髓芯減壓聯合富血小板血漿對兔激素性股骨頭壞死的療效及對金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶組織抑制劑系統的影響

于 鵬，紀志華，賈丙申*，周立義，付 昆

(海南醫學院第一附屬醫院關節創傷外科，海口 570102)

激素性股骨頭(steroid-induced necrosis of the femoral head，SANFH)壞死是一種由于激素誘導致使股骨頭發生循環障礙而變性、壞死的非創傷性損傷。髓心減壓術可以降低因股骨頭中骨組織水腫而引起的骨內壓增高，是治療早中期SANFH的常用微創術式。富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)含有豐富的生長因子，其配合髓心減壓術能夠促進非創傷性股骨頭壞死組織的成骨和骨再生[1]；而相關研究也表明，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其特異性抑制因子基質金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)與SANFH 的發生也存在一定關系[2]，即當機體長期承受大劑量激素時，糖皮質激素可以通過影響鈣離子的代謝、干擾內分泌系統等導致患者破骨細胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)上調并抑制骨保護素(osteoprotegerin, OPG)，使破骨細胞前體大量表達MMP-9及MMP-2，并抑制TIMP-1，TIMP-2 mRNA的表達。由于目前國內外均未見到髓芯減壓聯合PRP在治療激素性股骨頭壞死中對機體MMP/TIMP系統影響的研究，故本組研究擬探討髓芯減壓聯合PRP對兔激素性股骨頭壞死模型療效及股骨頭骨組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA 表達的影響，現將結果報道如下：

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5月齡SPF級新西蘭大白兔46只，雌雄各半，體質量2.5～3.0 kg，均購于海南省農業科學院畜牧獸醫研究所[SCXK(瓊)2014-0006]。采用實驗室嚙齒類動物標準飼料飼養，室溫及濕度分別控制在20℃～25℃，70%。動物實驗操作程序經本院動物倫理委員會審議批準[SYXK(瓊)2014-0017]。

1.2 主要試劑與儀器

醋酸潑尼松龍及生理鹽水由湖北制藥有限公司提供；大腸桿菌內毒素由武漢博士德生物工程公司提供；Trizol 試劑盒由美國Invitrogen 公司提供；RT-PCR 試劑盒由立陶宛Fermentas公司提供；酶免分析儀由美國Thermo Forma 公司提供；ABI 7000 型實時定量PCR 儀及ABI Prism 7000 SDS 軟件均由美國ABI公司提供；Image-Pro Plus 5.0計算機圖像分析系統來自于美國Media Cybernetics 公司；MDGS圖像分析系統來自于德國Zeiss 公司；兔自體血液富集提取富血小板血漿。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立與分組

按隨機數字法選取32只試驗兔，建立股骨頭無菌性壞死動物模型，即靜脈注射10 μg/kg 大腸桿菌內毒素(LPS)2次，注射間隔為24 h，在第2次注射LPS后，臀肌注射醋酸潑尼松龍20 mg/kg，注射3次，每次注射間隔為24 h。注射3次后第4周，對32只試驗兔進行核磁共振成像檢查股骨頭壞死模型情況，根據世界骨循環研究會制定的國際骨壞死分期標準[3]，選取其中處于I、II期階段骨壞死的試驗兔共28只，按隨機數字法分為減壓組、聯合組各14只，另取剩下的14只未進行造模的試驗兔設為對照組。對聯合組靜脈取血5 mL，采用改良Appel法制備PRP(濃度均3%)備用，制備方法如下[4]：裝有枸櫞酸鈉溶液的10 mL 注射器從兔耳中央動脈采集血液 5 mL，置入離心管，將其搖勻，首先以 2400 r/min 低速離心 10 min，可見離心管中分為上層的清液及下層的紅細胞，吸取上清液，交界層下少部分細胞置入另一離心管，以3600 r/min 高速離心 15 min，離心后棄去上清液上 3/4, 然后輕輕搖勻剩余液體，PRP 即制備完成。對減壓組和聯合組兩側股骨頭采取單純髓芯減壓和髓芯減壓聯合股骨頭內注射1 mL 3% PRP的處置。術后常規飲食。完全負重繼續單籠飼養，術后連續3 d每天減壓組及聯合組每只兔均臀大肌肌注硫酸慶大霉素2 mL，以預防術后感染。

表1 定量PCR序列

1.3.2 影像學檢查

術后2、6、10周對減壓組及聯合組實驗兔以3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射(30 mg/kg)，麻醉后仰臥位拍攝髖關節正位X線，觀察灶骨骨缺損及密度變化，Lane-Sandhu X線評分判斷成骨情況。

1.3.3 免疫生化指標

第10周拍片完畢后統一抽取減壓、聯合和空白對照組兔空腹靜脈血5 mL，離心分離，ELISA法檢測外周血IL-6濃度，并統一切除三組兔雙側股骨頭，其中先取100 mg右側股骨頭骨組織(取圓韌帶周圍骨組織)進行酶聯免疫ELISA法檢測組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白含量，再使用余下右側股骨頭骨組織檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的 mRNA表達水平，即首先取各組右側股骨頭，剔除軟骨，參照Trizol 試劑盒說明提取總RNA，電泳鑒定顯示提取總RNA 完整。取總RNA 500 ng加入隨機引物1 μL，參照RT-PCR 試劑盒合成cDNA 第1鏈，然后根據目的基因在GenBank 中的己知序列，采用Primer 5.0 軟件自行設計引物(見表1)。再采用三步法，反應條件均為：預變性95℃、35 s，1 個循環；變性95℃、5 s，退火58℃、20 s，延伸72℃、35 s，45 個循環。通過ABI Prism 7000 SDS 軟件對各組MMP-2、MMP-9、TIMP-1 和TIMP-2 目的基因作相對定量。

1.3.4 組織病理指標

將三組切下的左側股骨頭統一固定、包埋、切片、觀察病理學變化，股骨頭壞死診斷標準參照2006 年我國制定的《股骨頭壞死診斷與治療的專家建議》[5]鑒定是否發生骨壞死：以骨小梁的骨細胞空陷窩> 50%，且累及鄰近多處骨小梁，有骨髓壞死，確定為骨壞死；同時判斷三組骨陷窩空缺率。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 三組骨組織MMPs、TIMs的mRNA表達及IL-6水平和骨陷窩空缺率比較

三組目的基因RT-PCR結果見圖1。單因素方差分析顯示三組MMP-2表達兩兩比較q檢驗顯示，減壓組顯著高于聯合組和對照組(P< 0.05)；三組MMP-9表達兩兩比較q檢驗顯示，減壓組顯著高于聯合組和對照組(q=4.05, 5.06;P< 0.05)；三組TIMP-1表達兩兩比較q檢驗顯示，減壓組顯著低于聯合組和對照組(q=6.67, 8.89;P< 0.05)；三組TIMP-2表達兩兩比較減壓組顯著低于聯合組和對照組(q=6.70, 7.19;P< 0.05)；三組IL-6水平兩兩比較減壓組顯著高于聯合組和對照組(q=8.99, 13.09;P< 0.05)，同時聯合組也高于對照組(q=4.09;P< 0.05)(見表2)；三組骨陷窩空缺率減壓組顯著高于聯合組和對照組(q=32.60, 39.36;P< 0.05)，同時聯合組也高于對照組(q=6.75;P< 0.05) (見表2)；

2.2 減壓組、聯合組術后組間X線評分及新生骨面積百分比分析

影像學分析，術后2周兩組缺損區均呈現低密度，但聯合組密度高于減壓組。6周聯合組密度仍高于減壓組且缺損區有散在骨小梁出現。10周后減壓組灶骨下軟骨出現囊性變而聯合組密度接近正常(詳見圖2)。兩組X線評分示，術后6周和10周，聯合組均高于減壓組，差異有顯著性(P< 0.05)；而新生骨面積百分比，術后2周、6周、10周聯合組均高于減壓組(P< 0.05)(見表3)。

注：(1)減壓組；(2)聯合組；(3)對照組。圖1 三組MMPs和TIMPs的mRNA表達Note.(1)Decompression group；(2)Combined group；(3)Control group.Fig.1 mRNA expressions of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 in bone tissues of the femoral head

組別GroupsMMP-2(ng/mL)MMP-9(ng/mL)TIMP-1(ng/mL)TIMP-2(ng/mL)IL-6(pg/mL)骨陷窩空缺率(%)Rateofemptyosseouslacunae減壓組Decompressiongroup0.15±0.030.14±0.03*#0.09±0.03*#0.41±0.13*#8.88±1.55*#20.33±1.41*#聯合組Combinationgroup0.10±0.040.10±0.040.15±0.040.68±0.155.32±1.43#9.27±1.32#對照組Controlgroup0.09±0.030.09±0.040.17±0.030.70±0.173.70±1.466.98±1.05F12.767.17 21.41 16.13 44.83 442.90 P0.0000.0020.0000.0000.0000.000

注：與聯合組比較，*P< 0.05；與對照組比較，#P< 0.05。

Note.Compared with the combination group，*P< 0.05；Compared with the control group，#P< 0.05.

表3 減壓組、聯合組術后X線評分及新生骨面積比較

注：與聯合組比較，*P< 0.05。

Note.Compared with the combination group,*P< 0.05.

注：(A)減壓組術后2周；(B)聯合組術后2周；(C)減壓組術后6周；(D)聯合組術后6周；(E)減壓組術后10周；(F)聯合組術后10周。圖2 兩組術后2、6、10周影像學檢查情況Note.(A)Decompression group at 2 weeks.(B)Combination group at 2 weeks.(C)Decompression group at 6 weeks.(D)Combination group at 6 weeks.(E)Decompression group at 10 weeks.(F)Combination group at 10 weeks.Fig.2 X-ray films in each group at different time points after operation

注：(A)對照組；(B)減壓組；(C)聯合組。圖3 三組模型兔術后10周左側股骨頭HE染色結果(×200)Note.(A)Control group.(B)Decompression group.(C)Combination group.Fig.3 Histological observation of the bone tissues of the 3 groups at 10 weeks after operation. HE staining

2.3 組織病理學評價

對照組股骨頭骨組織可見骨小梁致密，期間為血管和骨髓，大部分骨陷窩內可見骨細胞；減壓組表現為骨小梁稀疏，周邊有骨壁形成，骨陷窩內骨細胞大部分消失，周圍有大量炎性肉芽組織，缺損中心為纖維組織，骨小梁有斷裂征象；聯合組輕度炎性細胞浸潤，但已可見成熟骨小梁及骨髓組織，多數小梁骨陷窩內可見骨細胞(見圖3)。

3 討論

髓芯減壓能夠在骨壞死后股骨頭內血流減少且伴有骨內壓增高時開放骨壞死腔，其降低骨內壓、改善骨內微循環、排除壞死組織、減輕骨髓水腫的效果較好，但由于SANFH患者壞死股骨頭內前體細胞增殖能力低，病損區成骨細胞缺乏導致單純的髓芯減壓并不能提升壞死區骨組織的再生[6-7]，且減壓后的組織其破骨和骨吸收的速度常大于骨結構的重建，反而會加速股骨頭的塌陷。PRP是通過離心從外周血得到的白細胞和血小板濃縮物，由于是用自體血制備，故不存在免疫原性。其含有豐富的纖維蛋白網絡、各型生長因子及炎性因子抑制物，能夠有效調整成骨細胞與破骨細胞的分化以及刺激新生血管和新骨的形成，除能增進組織修復、抑制炎癥反應、控制感染外還能構建生物支架[8]，同時由于其能促進局部骨髓間充質干細胞成骨分化，并抑制其向脂肪分化的作用，且兩種物質間存在生物協同效應。故本組研究會出現聯合組無論是影像學表現還是X評分，新生骨面積百分比，骨陷窩空缺率，骨組織病理學檢查均明顯優于減壓組的結果。

MMPs中MMP-2 和MMP-9在破骨細胞有大量表達，被認為是骨吸收過程中降解骨基質有機物成分的主要蛋白酶。同時在炎癥發生時，MMPs還能調控成骨細胞分化與破骨細胞的骨吸收從而進行病骨修復[9]。TIMP是MMPS 最重要的抑制因子，當MMPS降解骨及軟骨的病理改變發生時，可產生多種細胞因子，這些細胞因子能夠誘導產生TIMP對MMPS的酶活性進行抑制以達到平衡，因此MMPS/TIMP始終維持在一個動態平衡[10]。當機體長期承受大劑量激素時患者骨量丟失，激素也能直接或間接通過上調破骨細胞分化因子(RANKL)并抑制骨保護素(OPG)，導致破骨細胞前體的MMP-9及MMP-2大量的表達，并抑制TIMP-1TI、MP-2 mRNA的表達，即出現MMP/TIMP失衡變大，而MMP-9也可以通過機體出現激素性骨壞死產生的大量IL-6反饋性的上調RANKL，形成惡性循環，并且IL-6本身是炎性因子，也是主要的破骨細胞調節因子之一，可以上調MMP-2 的表達和分泌。故大劑量激素可以通過上述途徑直接或間接的上調MMP/TIMP[11]是ANFH發生的重要因素。本組研究結果顯示，術后聯合組MMP-2，MMP-9，IL-6顯著高于減壓組，而 TIMP-1，TIMP-2的表達顯著低于減壓組，同時其在MMP-2，MMP-9及TIMP-1，TIMP-2等指標表達上已與對照組相近，提示髓芯減壓聯合PRP在物理減壓消除水腫的同時可以通過抗炎、促進成骨細胞增殖等方式對MMP/TIMP系統起到“正性”干預作用，來拮抗糖皮質激素的“負性”作用，同時病理學檢查也能看到，聯合組股骨頭骨組織較單純減壓的骨組織有明顯好轉，已趨于正常組織的形態學表現，這也為臨床應用該聯合治療技術治療激素性股骨頭壞死提供了實驗依據。

雖然本組研究結果顯示髓芯減壓聯合PRP在治療激素性股骨頭壞死中，對組織MMP/TIMP系統的積極修復作用，但本實驗也有一些需要進一步研究的地方, 如無法證實生長因子的濃度與骨誘導的關系，同時，雖然兔作為SANFH模型的研究較多，但其在病程及病理變化上仍然與人類有較大差別[12]，并且因動物的體內環境與人體的生理環境并不相同，找到能夠與人體的生理環境相適應的生長因子的合理搭配比例以及更加適用于人體的支架材料仍有待于進一步解決。

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