手足口病病原體EV71的檢測方法學比較

付 輝，安麗娜，彭碧波

近30年來，全球新發(fā)傳染性疾病達40余種，中國目前發(fā)現(xiàn)20多種[1]。傳染病的暴發(fā)對人類的生命健康會造成嚴重威脅，已成為災(zāi)害救援醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點。其中，腸道病毒71型(enterovirus type 71，EV71)是人類腸道病毒之一，可通過糞口途徑或直接接觸感染者的呼吸道飛沫在人群中傳播[2]。EV71感染的臨床表現(xiàn)通常為手足口病(hand-foot and mouth disease，HFMD)，多感染5歲以下的兒童，受影響兒童經(jīng)常出現(xiàn)3～4 d發(fā)燒和手、腳、肘、膝和頰黏膜等部位的皰疹[3]。在大多數(shù)情況下，這種疾病是溫和、自限的。然而，EV71感染有時會導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如無菌性腦膜炎、腦炎、小兒麻痹癥樣癱瘓，甚至死亡。即便存活下來的患兒也會有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[4]。因此，對于HFMD病原體EV71的快速準確檢測對于臨床診斷治療尤為重要。本研究通過比較四種不同的方法對EV71感染的檢測，期望為臨床檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 非洲綠猴腎細胞(Vero)購自美國標準生物品收藏中心(American type culture collection，ATCC)，完全培養(yǎng)液為10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，1%雙抗(pen-strep)的MEM培養(yǎng)液，所有細胞均在含5% CO2的37 ℃ 孵箱中培養(yǎng)并傳代。病毒株EV71(H)株購自ATCC，于Vero細胞中傳代。

1.2 試劑耗材和儀器 一步法熒光定量試劑盒購自Invitrogen公司，總RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自QIAGEN公司，MEM液體培養(yǎng)液、青鏈霉素、胰酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和FBS購自Invitrogen公司，蛋白提取試劑和蛋白酶抑制劑購自Thermo公司，β-actin單抗和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗鼠二抗購自cell signaling公司，羊抗鼠綠色熒光二抗和免疫染色固定液購自碧云天生物技術(shù)研究所，EV71抗體購自Abnova公司。二氧化碳孵箱購自Thermo公司，倒置顯微鏡和熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司，Bio-Rad濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)購自BIO-RAD公司，ABI 7500 Fast 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)儀，購自ABI公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)法測定50%組織細胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50) 將3×104個/孔的Vero細胞接種于96孔板內(nèi)，待到細胞增長至75%的孔面積時，吸棄舊的培養(yǎng)液。將病毒原液按照10倍梯度依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。用不同稀釋度的病毒液100 μl/孔感染細胞1 h。1 h后吸棄病毒液，加入維持液100 μl/孔，將細胞放入37 ℃、5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)。觀察不同病毒濃度72 h的CPE，對觀察結(jié)果進行記錄。

將病毒感染細胞與正常細胞作對比，以細胞狀態(tài)改變或死亡比例分別標記為4(細胞死亡比例76%～100%)、3(細胞死亡比例51%～75%)、2(細胞死亡比例26%～50%)、1(細胞死亡比例0～25%)、0(細胞形態(tài)未發(fā)生變化或全部存活)，采用Reed & Muench方計算TCID50。

1.3.2 Real-Time PCR檢測 將9×105個/孔的Vero細胞接種于6孔板中，溫度37 ℃、 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去細胞培養(yǎng)液，使用RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA，使用一步法熒光定量試劑盒進行RT-PCR檢測，特異引物序列見表1。25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件50 ℃ 3 min，95 ℃ 10 min，40個循環(huán)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s)。采用Sybr-GreenER熒光檢測系統(tǒng)對目的基因進行相對定量分析， 采用看家基因β-actin作為內(nèi)參照對Ct值進行歸一化處理，基因表達差異計算方法采用ΔΔCt法。實驗重復(fù)3批，每批次3個復(fù)孔。

表1 特異引物序列

1.3.3 Western blot檢測 將9×105個/孔的Vero細胞接種于6孔板中，37 ℃、 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去細胞培養(yǎng)液，使用蛋白提取試劑提取細胞總蛋白后進行檢測。20 μg總蛋白上樣電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入EV71一抗(1∶1000)和β-actin一抗(1∶1000)，室溫孵育2 h后經(jīng)TBST洗脫，再孵育HRP標記羊抗鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h后經(jīng)TBST洗脫顯影。

1.3.4 免疫熒光法檢測 將9×105個/孔的Vero細胞接種于6孔板中，37 ℃、 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后感染100 TCID50EV71，1 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去細胞培養(yǎng)液，4 ℃ PBS洗3次。加入300 μl/孔固定液，固定10 min。4 ℃ PBS漂洗2次。加入0.5% Triton 穿孔15 min。4 ℃ PBS漂洗3次。1% BSA封閉1 h。TBST洗3次，加入含1% BSA的TBST稀釋的EV71抗體(1∶500)，于37 ℃雜交2 h。TBST漂洗3次，加入TBST稀釋的羊抗鼠熒光二抗(1∶500)，于37 ℃雜交1 h。TBST漂洗3次，觀察照像。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，不同感染量的病毒RNA改變水平的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 TCID50測定結(jié)果 首先利用CPE法檢測EV71病毒毒力，病毒感染72 h后觀察記錄細胞病變見表2，經(jīng)計算其TCID50為10-4。

2.2 Western blot檢測結(jié)果 如圖1所示，利用Western blot檢測EV71蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)EV71感染24 h后即可檢測到明顯的病毒蛋白表達，并且病毒感染量越高， 檢測到的條帶越清晰。 而10-5感染量的病毒24 h無法檢測病毒蛋白的條帶。

表2 不同稀釋濃度手足口病病原體EV71病毒液感染校后72 h的CPE

注：CPE, 細胞病變效應(yīng)；10-6、10-7和10-8組CPE觀察結(jié)果均記作0

圖1 手足口病病原體EV71感染24 h后各病毒量病毒蛋白的表達

2.3 免疫熒光法檢測結(jié)果 如圖2所示，利用免疫熒光法檢測EV71蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)EV71感染24 h后即可檢測到明顯的病毒蛋白表達，并且病毒感染量越高，檢測到的熒光越多。而10-5感染量的病毒24 h只能檢測到較少熒光。

圖2 手足口病病原體EV71感染24 h后各病毒量病毒蛋白的表達

2.4 Real-Time PCR檢測結(jié)果 如圖3所示，采用Real-Time PCR檢測，可以靈敏地檢測到病毒RNA，即使其他方法檢測不到的10-5感染量，Real-Time PCR法也可以檢測到。

圖3 手足口病病原體EV71不同感染量病毒的RNA的水平

3 討 論

EV71于1969年首次從美國加州患者身上分離得到，隨后在全球范圍內(nèi)多次暴發(fā)[5-9]。EV71感染引起的HFMD主要臨床癥狀為手、足和口腔黏膜的皰疹病變，少數(shù)重癥感染者還可引起腦炎、無菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓炎等神經(jīng)系統(tǒng)組織的病變，甚至死亡[10,11]。自2008 年以來，中國HFMD發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈逐年上升趨勢，將會嚴重影響社會的穩(wěn)定與發(fā)展[12]。對于EV71的早期、快速、準確診斷對于臨床治療十分重要，在病毒感染尚未對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴重損害之前進行治療，防止神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生對于兒童的成長發(fā)育至關(guān)重要。本研究通過對不同方法學的比較來研究適合不同情況EV71感染的診斷，旨在為臨床有效快速檢測和治療提供依據(jù)。

目前對于EV71的檢測有各種不同的方法，均有各自的優(yōu)缺點，以便于EV71感染不同階段的檢測。本研究利用4種不同實驗方法對EV71的感染進行了檢測，發(fā)現(xiàn)4種方法都可檢測到EV71的感染，只是不同的方法對病毒感染量的敏感性不同，整個實驗周期也不同，對實驗人員的操作要求也不同。其中，CPE法是最容易、簡便的方法，但是實驗周期太長且靈敏度低。Western blot方法對于病毒感染量有一定要求，較低的感染量無法檢測病毒，但是相對于CPE方法全程至少96 h，Western blot法所需時間減少。免疫熒光法和Western blot法所需時間和檢測到的結(jié)果基本一致，對于病毒感染量同樣有一定要求，較低的感染量無法檢測病毒。Real-Time PCR是4種方法中最靈敏，同時也是最快速的方法，48 h即可完成檢測。因此，對于臨床就診的患者可以根據(jù)已經(jīng)發(fā)病的程度選擇一種或幾種合適的方法對病原體進行快速、準確的確定，為臨床用藥治療提供依據(jù)。

除了本研究所利用的實驗方法，目前還有基因微陣列檢測[13]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked imnnosoboynt assay,ELISA)兩種檢測方法，可用于EV71感染的測定，這兩種方法同樣有著各自優(yōu)缺點。目前臨床上應(yīng)用較多的還是Real-Time PCR和ELISA這兩種方法，隨著實驗技術(shù)的不斷創(chuàng)新，相信在不久的將來會有更多更加完善的適合臨床檢測的方法被應(yīng)用到實踐中，為一線醫(yī)護工作者提供更好的診斷支撐，為HFMD的預(yù)防和治療提供更好的保障。

[1] 吳改娥，郭建勛. 近五年全球主要新發(fā)感染性疾病防治現(xiàn)狀[J]. 中華災(zāi)害救援醫(yī)學, 2014, 2(10): 592-599.

[2] Zhu M, Duan H, Gao M,etal. Both ERK1 and ERK2 are required for enterovirus 71 (EV71) efficient replication [J]. Viruses, 2015, 7(3): 1344-1356.

[3] McMinn P C. Recent advances in the molecular epidemiology and control of human enterovirus 71 infection [J]. Curr Opin Virol, 2012, 2(2): 199-205.

[4] Wang X, Zhu C, Bao W,etal. Characterization of full-length enterovirus 71 strains from severe and mild disease patients in northeastern China [J]. PLoS One, 2012, 7(3): e32405.

[5] Wang H Q, Meng S, Li Z R,etal. The antiviral effect of 7-hydroxyisoflavone against Enterovirus 71 in vitro [J]. J Asian Nat Prod Res, 2013, 15(4): 382-389.

[6] Blomberg J, Lycke E, Ahlfors K,etal. Letter: New enterovirus type associated with aseptic meningitis and/or hand, foot and mouth disease [J]. Lancet, 1974, 2(7872): 112.

[7] Hagiwara A, Tagaya I, Yoneyama T. Epidemic of hand, foot and mouth disease associated with enterovirus 71 infection [J]. Intervirology, 1978, 9(1): 60-63.

[8] Wang J R, Tuan Y C, Tsai H P,etal. Change of major genotype of enterovirus 71 in outbreaks of hand-foot-and-mouth disease in taiwan between 1998 and 2000 [J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(1): 10-15.

[9] Huang S W, Hsu Y W, Smith D J,etal. Reemergence of enterovirus 71 in 2008 in Taiwan: dynamics of genetic and antigenic evolution from 1998 to 2008 [J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(11): 3653-3662.

[10] Chen S G, Cheng M L, Chen K H,etal. Antiviral activities of Schizonepeta tenuifolia Briq. against enterovirus 71 in vitro and in vivo [J]. Sci Rep, 2017,20(7): 935.

[11] Yi E J, Shin Y J, Kim J H,etal. Enterovirus 71 infection and vaccines [J]. Clin Exp Vaccine Res, 2017, 6(1): 4-14.

[12] Yang F, Ren L, Xiong Z,etal. Enterovirus 71 outbreak in the People’s Republic of China in 2008 [J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(7): 2351-2352.

[13] Chen T C, Chen G W, Hsiung C A,etal. Combining multiplex reverse transcription-PCR and a diagnostic microarray to detect and differentiate enterovirus 71 and coxsackievirus A16 [J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(6): 2212-2219.