補腎健脾益氣方對慢性阻塞性肺疾病大鼠瘦素及瘦素受體表達的影響*

馮月娟王燦燦童岳陽郁東偉施凱徐永芳黃旭晴王建峰徐婷呂玉寶徐長青#

1 杭州師范大學附屬醫院 浙江 杭州 310015

2 復旦大學附屬華山醫院 上海 020040

筆者在前期實驗研究顯示補腎健脾益氣方通過抑制瘦素及瘦素受體改善實驗性慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠免疫炎癥反應，為進一步揭示該方延緩因COPD導致的骨骼肌丟失的分子生物學機制，進行實驗。報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：大鼠血清瘦素、瘦素受體、TNF-α和IL-6試劑盒購于上海西塘生物科技有限公司；大鼠骨骼肌瘦素及瘦素受體Real-time PCR試劑盒購于寶生物工程有限公司；大鼠骨骼肌瘦素及瘦素受體Westernblot相關試劑盒購于寶生物工程有限公司。

1.2 分組與動物模型建立：健康純系SD雄性大鼠60只，體質量120±20g，按體質量層次隨機抽取15只為正常對照組，基礎飼料喂養，連續12周，余下45只作為慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）模型組和補腎健脾益氣方組（高劑量組和低劑量組），利用經典熏香煙方案[1]制作大鼠COPD模型。模型組基礎飼料喂養，補腎健脾益氣方組中藥灌胃，每天1次（根據實驗動物用藥劑量換算表，將人的補腎健脾益氣方臨床劑量換算成大鼠的劑量，分為高劑量和低劑量組，高劑量為原有成人劑量的2倍）。模型組乙醚麻醉，處死取血及后腿骨骼肌，利用小動物呼吸機驗證造模成功。

1.3 用藥方案：補腎健脾益氣方，本院制劑室提供，組成：仙靈脾、黃芪各30g，仙茅15g，黨參、白術、茯苓、懷山藥各10g，補骨脂、山萸肉、柴胡各12g，甘草6g?？勺们樵黾幼咸K、熟地、地龍各12g，麥冬、丹參各15g，川貝5g，五味子9g。根據實驗動物用藥劑量換算表[2]，將人的補腎健脾益氣方臨床劑量換算成大鼠的劑量，濃縮成2ml藥物,模型組及復方治療高劑量組和低劑量組每日灌胃1次，連續灌胃12周。

1.4 指標檢測：采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清瘦素、瘦素受體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平；Real-timePCR檢測補腎健脾益氣方干預慢阻肺大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受體mRNA水平；Western blot法檢測慢阻肺大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達。

1.5 統計學方法：統計軟件采用SPSS 18.0版，計量資料以±s表示，組間統計采用單因素方差分析，P＜0.05為統計有差異的標準。

2 結果

2.1 各組血清瘦素、瘦素受體水平比較：見表1。

表1 各組血清瘦素、瘦素受體水平（ng/ml）

2.2 各組血清TNF-α和IL-6水平比較：見表2。

表2 各組血清TNF-α和IL-6水平（ng/ml）

2.3 各組骨骼肌瘦素及其受體mRNA表達比較：見表3。

表3 各組骨骼肌瘦素和瘦素受體mRNA表達

2.4 各組大鼠骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達比較：

Western blot檢測報告提示，與正常對照組（光密度值：1426.854）相比較，大鼠慢阻肺模型組（光密度值：149932.163）骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達有所增加（光密度值分別與內參GAPDH比較）。與慢阻肺模型組比較，高劑量組和低劑量組瘦素表達水平有所降低。就骨骼肌瘦素而言，高劑量組光密度值（光密度值：91822.987）較慢阻肺模型組光密度值下降更明顯，提示高劑量組有更強的抑制慢阻肺模型瘦素水平的作用。就骨骼肌瘦素受體而言，與慢阻肺模型組比較，高劑量組（光密度值：73501.658）比低劑量組瘦素受體表達水平下降明顯。

3 討論

慢性阻塞性肺疾病穩定期多屬本虛為主，標實為次，肺、脾、腎三臟虛損是COPD發生發展及反復發作的內在條件，“脾為肺之母”，脾虛日久必然損傷氣血津液等精微物質化生不足，四肢骨骼肌肉失于濡養，最終導致肌肉萎縮及功能障礙。COPD肌肉萎縮、肌肉乏力和疲勞癥狀屬于中醫學“痿癥”“痿蹩。中醫學認為，脾在體合肉，主四肢，全身的肌肉四肢，都有賴于脾胃運化的水谷精微及津液的營養滋潤，才能壯實豐滿，活動靈活有力，故強調健脾的治療。所用方中，仙靈脾、仙茅補肝腎之不足，溫壯元陽、溫腎助陽納氣；補骨脂補腎溫脾陽；山萸肉滋腎；黨參、白術、茯苓、懷山藥、炙甘草健脾補中，益氣健脾化痰以堵生痰之源，培土生金，且扶土上可蔭肺，下可制水，實為治本之法；黃芪補氣升陽，益氣固表；北柴胡升舉脾氣，使氣血得予輸布經脈五臟。

表1結果表明，與正常組比較，復方治療高劑量組和低劑量組血清瘦素水平增加程度較血清瘦素受體水平更加明顯，可能機制是補腎健脾益氣方具有其他作用機理可以不經過瘦素受體通路降低血清中瘦素水平，其具體機制有待進一步研究。

慢阻肺特征性病理生理改變是氣道、肺實質及肺血管的慢性炎癥性病變，炎癥細胞釋放的炎癥因子和炎癥趨化因子在慢阻肺的炎癥反應及免疫應答中起重要作用。表2結果表明，提示補腎健脾益氣方高劑量組具有明顯的抑制外周血炎癥反應的作用，究其原因可能因本復方中主要藥物淫羊藿具有抑制炎癥反應，抑制核轉錄因子（NF-κb）有關，這個結果與淫羊藿單體淫羊藿苷相關研究結果相一致[3-4]。

為進一步明確補腎健脾益氣方降低血清中瘦素瘦素受體的可能機制，筆者采用Real-time PCR檢測各組大鼠后腿骨骼肌中瘦素及瘦素受體mRNA表達。表3結果顯示：與正常組比較，大鼠慢阻肺模型組骨骼肌瘦素和瘦素受體mRNA表達有所升高（P＜0.01），提示慢性炎癥浸潤可以增加瘦素及瘦素受體的表達。與慢阻肺模型組相比較，復方治療高劑量組和低劑量組骨骼肌瘦素和骨骼肌瘦素受體吸光度均降低，但復方治療高劑量組降低更加明顯（P＜0.01），提示復方治療組可以降低骨骼肌瘦素mRNA表達。

筆者為深入研究，采用Western blot檢測各組大鼠后腿骨骼肌瘦素及瘦素受體表達，實驗結果提示，與正常組（光密度值：1426.854）比較，大鼠慢阻肺模型組（光密度值：149932.163）骨骼肌瘦素和瘦素受體蛋白表達有所增加（光密度值分別與內參GAPDH比較）。與模型組比較，高劑量組和低劑量組瘦素表達水平有所降低。就骨骼肌瘦素而言，高劑量組光密度值（光密度值：91822.987）較模型組下降更明顯，提示復高劑量組有更強的抑制慢阻肺模型瘦素水平的作用。就骨骼肌瘦素受體而言，與模型組比較，高劑量組（光密度值：73501.658）比低劑量組瘦素受體表達水平下降明顯。

骨骼肌功能障礙作為慢阻肺的主要肺外表現，是評估慢阻肺預后的重要標準之一，慢阻肺患者存在肺腎氣虛、肺脾氣虛[5]，既可造成骨骼肌能量供需障礙，同時也會導致其內在結構的變化，使得患者的呼吸肌萎軟失用，不耐疲勞，致肺失清宣，而成氣逆喘咳。因此補腎健脾益氣使脾氣得健，有利于加強肌肉的營養，減少呼吸肌蛋白的分解，改善骨骼肌能源物質的供給，從而增強呼吸肌收縮力及耐力，減輕呼吸肌疲勞，減輕氣促等不適癥狀，提高生活質量。本實驗以補腎健脾益氣為法，按照隨機對照的原則對大鼠慢阻肺模型進行研究，嘗試評價補腎健脾益氣對于改善慢阻肺的呼吸肌疲勞、抗炎和調節免疫等方面的療效，為臨床治療慢性阻塞性肺疾病提供科學而客觀的實驗研究資料。

[1]林江濤,翁心植.慢性阻塞性肺疾病與肺源性心臟病[M].北京：北京出版社，1999：366-381.

[2]宋小蓮,王昌惠,白沖.脂多糖結合熏煙法和單純熏煙法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比較[J].第二軍醫大學學報,2010,31(3)：246-249.

[3]Xu CQ,Liu BJ,Wu JF,et al.Icariin attenuates LPS-inducedacute in flammatory responses：involvement of PI3K/Akt and NF-kappaB signaling pathway[J].Eur J Pharmacol.2010，642(1-3)：146-153.

[4]吳金峰,董競成,徐長青,等.淫羊藿苷拮抗脂多糖炎癥模型的體內和體外研究[J].中國中西醫結合雜志，2009，29(4)：330-334.

[5]中華中醫藥學會內科分會肺系病專業委員會.慢性阻塞性肺疾病中醫證候診斷標準(2011版)[J].中醫雜志，2012,53(2)：177-178.