外周血粒淋比聯合腫瘤相關中性粒細胞對術后胃癌患者預后的影響*

黃曉培 朱江波 常文軍 張曉芳 張天寶 康爭春 薛偉

胃癌是中國常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率在惡性腫瘤中居第3位［1］。近年來，隨著診斷治療水平的提高及人們飲食習慣的改變，胃癌的發病率、病死率有下降的趨勢。但由于存在復發和轉移，胃癌患者的預后仍然較差。準確地評估胃癌患者的預后并對預后較差的患者施以輔助化療、免疫治療等方法，可極大地改善患者的預后。目前TNM分期是最重要的評估胃癌預后的方法，但即使同一TNM分期的患者，預后仍然存在較大的差別。因此，亟待找到一種新的評價體系更好地評估胃癌患者的預后。

近年來，外周血中性粒細胞與淋巴細胞的比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）和惡性腫瘤預后的相關性成為研究者關注的熱點，目前已證實NLR與胃癌、結腸癌、肝細胞癌等惡性腫瘤的預后密切相關［2-4］。但其靈敏性、特異性均較差，暫未應用于臨床作為預測胃癌預后的重要指標。腫瘤相關中性粒細胞（tumor-associated neutrophils，TANs）作為腫瘤微環境的重要成員，也已證實與胃癌的預后密切相關［5］。上述研究僅是單一地分析血液或腫瘤組織中中性粒細胞對胃癌預后的影響，并不能反映中性粒細胞對胃癌的綜合影響，因而對胃癌患者預后的判斷存在較大的限制。本研究旨在探討外周血NLR聯合腫瘤組織TANs浸潤對預后的預測價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

隨機選取第二軍醫大學附屬長海醫院2006年6月至2011年5月收治的180例胃癌患者，所有患者均行手術切除術。將其中隨訪資料完整、術前均未行放化療及其他抗腫瘤治療，且自身未患免疫系統相關疾病的126例胃癌患者納入研究。胃癌患者的統計學資料及臨床病理學特征包括：性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、是否行輔助放化療、血清中癌胚抗原（CEA）和糖類抗原（CA199）水平。腫瘤的TNM分期根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）制定的胃癌TNM分期（第7版）標準確定。本研究得到第二軍醫大學長海醫院的科研機構審查委員會的批準，所有患者均被告知并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法和指標 患者術前一周內采集靜脈血進行血細胞計數及分類，計算中性粒細胞與淋巴細胞的比值。以NLR=4為分界點［6-7］，將其分為高NLR組和低NLR組。采用免疫組織化學法檢測胃癌組織中CD66b抗原，判斷胃癌組織中CD66b蛋白的表達從而鑒定組織中的腫瘤相關中性粒細胞［8］。石蠟包埋的組織切片，由上海芯超生物科技有限公司制成組織芯片。65℃烤片，常規脫蠟水化，用30%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶。用檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復。抗CD66b抗體（G10F5，BD Biosciences，美國，抗體稀釋倍數1:400）4℃孵育過夜。免疫組織化學試劑盒（KIF-5920，maxim，美國）用于孵育二抗及DAB顯色。隨后蘇木素復染，脫水透明封片。1.2.2 免疫組織化學染色結果判斷標準 用Aperio公司（美國）病理切片掃描成像系統掃描組織芯片并用Aperio Image Scope version軟件（美國）讀片。CD66b蛋白存在于腫瘤細胞間質，出現黃褐色或棕色顆粒為陽性。選擇5個染色均勻的區域，在0.05 mm2的面積內計算CD66b中性粒細胞浸潤數目，取其平均值視為該組織內中性粒細胞的浸潤個數。免疫組織化學評分由4位研究者（2名病理專家和2名臨床醫師）采用盲法閱片判定，評分有較大分歧時經協商解決。取4例計數的平均值作為該樣本最終結果。將結果的中位數作為標準，將126例胃癌患者分為高浸潤組和低浸潤組。

1.2.3 隨訪 患者首程治療結束后2年內每3個月復查1次，3～5年內每6個月復查1次。復查主要包括常規體格檢查、血常規、肝腎功能及影像學檢查。通過電話進行隨訪。隨訪開始于患者出院，終止于患者死亡，隨訪截止時間為2015年6月。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。外周血中NLR聯合胃癌組織中CD66b蛋白表達與臨床病理因素的相關性，采用χ2檢驗或Mann-Whitney U進行檢驗。采用Kaplan-Meier生存分析及Log-rank比較外周血中NLR聯合胃癌組織中CD66b中性粒細胞浸潤高低與預后的關系。多因素Cox回歸分析用于識別與胃癌預后相關的獨立危險因素。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CD66b在胃癌組織中的表達

在126例胃癌組織樣本中，63例CD66b高表達，63例CD66b低表達，且均表達于胃癌組織間質內。胃癌組織CD66b高、低表達的代表性免疫組織化學檢測結果見圖1。

圖1 CD66b在胃癌組織中的表達（IHC×200）

2.2 外周血中NLR聯合胃癌組織中TANs浸潤與臨床病理特征之間的關系

將外周血中NLR高低與胃癌組織中TANs浸潤高低聯合后，共分為4個組，分別為NLR高合并TANs高浸潤組、NLR高合并TANs低浸潤組、NLR低合并TANs高浸潤組和NLR低合并TANs低浸潤組。經分析，發現外周血高NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤患者與年齡、性別、TNM分期、輔助放化療、血清CEA水平不相關。外周血高NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤患者與分化程度和腫瘤大小相關，差異具有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 胃癌患者外周血NLR聯合組織中CD66b蛋白表達與臨床病理特征的相關性

2.3 生存分析

生存分析及Log-rank分析結果顯示，外周血高NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤組生存率最低，外周血低NLR聯合胃癌組織TANs高浸潤組生存率最高，而外周血高NLR聯合胃癌組織TANs高浸潤組與外周血低NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤組比較，差異無統計學意義，其他各組差異均具有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

2.4 單因素及多因素Cox回歸分析

患者總生存期的單因素Cox回歸分析顯示，外周血高NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.008），腫瘤個體較大（P＜0.001）、高TNM分期（P＜0.001）、輔助放化療（P=0.005）、血清CA199水平高（P=0.012）是影響胃癌預后的獨立危險因素；將單因素回歸分析有意義的變量進一步納入Cox多因素回歸分析顯示，外周血高NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.042），腫瘤個體大（P=0.048）、高TNM分期（P=0.005）、輔助放化療（P=0.026）、血清CA199水平（P=0.015）是影響胃癌預后的獨立危險因素（表2）。患者無病生存期的單因素Cox回歸分析顯示，外周血高NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.008），腫瘤較大（P＜0.001）、高TNM分期（P＜0.001）、輔助放化療（P=0.005）、血清CA199水平較高（P=0.014）是影響胃癌預后的獨立危險因素；進一步納入多因素回歸分析顯示，外周血高NLR聯合胃癌組織TANs低浸潤（P=0.046），高TNM分期（P=0.005）、放化療（P=0.028）、血清CEA199水平較高（P=0.024）是影響胃癌預后的獨立危險因素（表3）。

圖2 胃癌患者血液NLR聯合組織中CD66b表達的生存分析

表2 胃癌患者總生存期的單因素及多因素Cox回歸分析

表3 胃癌患者無病生存期的單因素及多因素Cox回歸分析

表3 胃癌患者無病生存期的單因素及多因素Cox回歸分析（續表3）

3 討論

外周血及組織中的中性粒細胞具有相同的來源。中性粒細胞來源于骨髓造血干細胞，在骨髓干細胞分化發育后，進入血液或組織中。當局部組織發生感染時，中性粒細胞能夠滲出血管，通過趨化運動等機制到達感染部位，發揮機體免疫防御功能。然而，隨著研究的進展，除了發揮抗感染作用，組織中的TANs與胃癌的發生、發展也存在密切關系［9］。有研究發現，TANs受到來源于腫瘤微環境的不同信號影響可分化為N1、N2型，N1型主要通過殺傷病原體，產生免疫反應等抑制腫瘤的進展，N2型主要通過促進細胞的增殖、侵襲，細胞外基質的重建，血管、淋巴管的形成等而促進腫瘤的進展［10］。由此可見，血液和組織中的中性粒細胞之間可能存在著某種聯系，共同促進胃癌的進展。目前，尚缺乏區分N1、N2型中性粒細胞較好的標志物，而CD66b作為中性粒細胞的標志物被廣泛應用。因此，本研究檢測血液中NLR和胃癌組織中總的中性粒細胞的浸潤情況，研究其聯合作用對胃癌患者預后的預測價值。

目前，雖缺乏外周血中NLR聯合胃癌組織中的中性粒細胞浸潤與胃癌預后的研究，但關于外周血NLR與胃癌預后關系的研究較多。Jin等［11］對1 220例非手術治療的晚期胃癌患者的研究中發現，NLR升高是患者總生存期縮短的獨立預后因素。Aliustaoglu等［12］發現術前NLR是行根治性切除并在術后實施輔助化療的胃癌患者總生存期和無病生存期的獨立危險因素。Hottenrott等［13］指出NLR升高是相對早期胃癌病例的獨立危險因素。本研究結果顯示，外周血NLR高聯合組織中性粒細胞低浸潤提示胃癌患者預后較差，與上述研究結果一致。關于胃癌組織中TANs與胃癌預后相關性的研究結果說法不一。有研究顯示，胃癌組織中TANs高浸潤提示預后較好［5］。Zhao等［14］研究表明，胃癌組織中TANs高浸潤提示預后較差。出現此差異的可能原因為前者采用CD66b標記中性粒細胞，后者采用CD15標記中性粒細胞。CD15不僅可以表達于中性粒細胞，也可表達于單核細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞和腫瘤細胞等，可能造成了對預后估計的偏差［15］。CD66b是高度糖基化的CEA家族蛋白，由CGM6基因編碼，表達于嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。使用高通量篩選流式細胞術檢測發現CD66b識別中性粒細胞的純度為99%［16］，且CD66b已被廣泛應用于腎細胞癌，肝癌和胃癌等腫瘤以識別嗜中性粒細胞［17-18］。本研究結果表明，中性粒細胞高浸潤胃癌患者預后較好，與既往研究結果一致，具有一定的可靠性。

血液和組織中的中性粒細胞均可影響胃癌患者的預后。外周血NLR升高引起胃癌患者預后較差的原因可能為：1）中性粒細胞升高可引起生長因子和血管內皮生長因子等一系列促腫瘤血管形成的物質增加，從而促進腫瘤的生長和增殖［19-20］；2）NLR的升高提示淋巴細胞計數相對或絕對減少，從而降低機體對腫瘤的免疫應答［21］。而組織中N2型TANs可以通過產生活性氧、生成基質金屬蛋白酶、血管內皮生長因子等促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、細胞外基質重建，血管、淋巴管的形成等。另外，N1型TANs可通過分泌基質金屬蛋白酶，與腫瘤細胞直接作用等發揮抗腫瘤作用，也可招募CD8+T淋巴細胞抑制腫瘤的進展。目前，關于血液和腫瘤組織中中性粒細胞相互作用的研究較少。本研究結果表明，外周血NLR高聯合組織TANs低浸潤提示胃癌患者預后較差，推測血液中的中性粒細胞滲透血管到達組織后，可能仍然與血液中的中性粒細胞存在相互作用。因此，未來亟需深入探究血液及胃癌組織中的中性粒細胞相互作用方式與促瘤或抑瘤作用及其機制，不僅可引導免疫系統發揮抗腫瘤作用，也可為尋找胃癌治療新靶點提供科學依據。

尋找一種精確的評價腫瘤患者預后的方法是一直以來研究的熱點。TNM分期是目前評估胃癌患者預后的主要方法。但判斷預后不能僅靠單一指標，既要考慮到腫瘤相關的因素（如TNM分期）還應考慮到患者本身的免疫狀態，以及腫瘤與機體的免疫炎癥、反應介質等。通過多因素Cox回歸分析發現：外周血高NLR聯合胃癌組織中TANs低浸潤、腫瘤體積大、高TNM分期、輔助放化療、血清CA199水平是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。因此，以上述指標建立一個綜合的預后評分系統更能準確地評估患者的預后，但需要更有力的證據支持。

綜上所述，術前外周血NLR聯合胃癌組織中TANs浸潤可作為判斷胃癌患者術后預后的指標，且術前外周血NLR高聯合胃癌組織中TANs低浸潤胃癌患者的預后較差。外周血NLR高聯合胃癌組織TANs低浸潤有望成為預測胃癌預后的新的生物標志物，且兩者聯合可提高對預后的預測能力。本研究不足之處在于樣本量偏小及回顧性研究，對于胃癌患者外周血液NLR聯合胃癌組織中TANs浸潤與患者臨床病理特征及預后的相關性仍需進一步研究。

[1]Chen W,Zheng R,Zeng H,et al.Annual report on status of cancer in China[J].Chin J Cancer Res,2015,27(1):2-12.

[2]Roxburgh CS,McMillan DC.Role of systemic inflammatory response in predicting survival in patients with primary operable cancer[J].Future Oncol,2010,6(1):149-163.

[3]Jung MR,Park YK,Jeong O,et al.Elevated preoperative neutrophil to lymphocyte ratio predicts poor survival following resection in late stage gastric cancer[J].J Surg Oncol,2011,104(5):504-510.

[4]Halazun KJ,Aldoori A,Malik HZ,et al.Elevated preoperative neutrophil to lymphocyte ratio predicts survival following hepatic resection for colorectal liver metastases[J].Eur J Surg Oncol,2008,34(1):55-60.

[5]Zhang H,Liu H,Shen Z,et al.Tumor-infiltrating neutrophils is prognostic and predictive for postoperative adjuvant chemotherapy benefit in patients with gastric cancer[J].Ann Surg,2018,267(2):311-318.

[6]Templeton AJ,McNamara MG,Seruga B,et al.Prognostic role of neutrophil-to-lymphocyte ratio in solid tumors:a systematic review and meta-analysis[J].J Natl Cancer Inst,2014,106(6):dju124.

[7]Shimada H,Takiguchi N,Kainuma O,et al.High preoperative neutrophil-lymphocyte ratio predicts poor survival in patients with gastric cancer[J].Gastric Cancer,2010,13(3):170-176.

[8]Stocks SC,Ruchaud-Sparagano MH,Kerr MA,et al.CD66:role in the regulation of neutrophil effector function[J].Eur J Immunol,1996,26(12):2924-2932

[9]Fridlender ZG,Albelda SM.Tumor-associated neutrophils:friend or foe[J]?Carcinogenesis,2012,33(5):949-955.

[10]Fridlender ZG,Sun J,Kim S,et al.Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta:"N1"versus"N2"TAN[J].Cancer Cell,2009,16(3):183-194.

[11]Jin H,Sun J,Zhu K,et al.The prognostic value of neutrophil-lymphocyte ratio is superior to derived neutrophil-lymphocyte ratio in advanced gastric cancer treated with preoperative chemotherapy and sequential R0 resection:a 5-year follow-up[J].Onco Targets Ther,2017(10):2655-2664.

[12]Aliustaoglu M,Bilici A,Ustaalioglu BB,et al.The effect of peripheral blood values on prognosis of patients with locally advanced gastric cancer before treatment[J].Med Oncol,2010,27(4):1060-1065.

[13]Hottenrott C,Katsios C.Prognostic significance of host-and tumorrelated factors in patients with gastric cancer[J].World J Surg,2010,34(10):2496-2497.

[14]Zhao JJ,Pan K,Wang W,et al.The prognostic value of tumor-infiltrating neutrophils in gastric adenocarcinoma after resection[J].PLoS One,2012,7(3):e33655.

[15]Phillips ML,Nudelman E,Gaeta FC,et al.ELAM-1 mediates cell adhesion by recognition of a carbohydrate ligand,sialyl-Lex[J].Science,1990,250(4984):1130-1132.

[16]Lakschevitz FS,Hassanpour S,Rubin A,et al.Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using highthroughput screening flow cytometry[J].Exp Cell Res,2016,342(2):200-209.

[17]Abe H,Morikawa T,Saito R,et al.In Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma a high density of CD66b-positive tumor-associated neutrophils is associated with intestinal-type histology and low frequency of lymph node metastasis[J].Virchows Arch,2016,468(5):539-548.

[18]Zhou SL,Zhou ZJ,Hu ZQ,et al.Tumor-associated neutrophils recruit macrophages and T-regulatory cells to promote progression of hepatocellular carcinoma and resistance to sorafenib[J].Gastroenterology,2016,150(7):1646-1658.

[19]Dan JQ,Zhang YJ,Peng ZW,et al.Postoperative neutrophil-to-Lymphocyte ratio change predicts survival of patients with small hepatocellular carcinoma undergoing radiofrequency ablation[J].Plos One,2013,8(3):e58184.

[20]Gomez D,Morris-Stiff G,Toogood GJ,et al.Impact of systemic inflammation on outcome following resection for intrahepatic cholangiocarcinoma[J].J Surg Oncol,2008,97(6):513-518.

[21]Ding PR,An X,Zhang RX,et al.AnElevated preoperative neutrophil to lymphocyte ratio predicts risk of recurrence following curative resection for stageⅡA colon cancer[J].Int J Colorectal Dis,2010,25(12):1427-1433.