五福飲治療膝骨關節炎大鼠模型實驗研究

王敏龍 盧德趙 葉興法 錢木水 沈欽榮

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是最常見的關節疾病，具有發病率高、致殘率高、治療花費高以及易反復的特點[1]。近年來，中藥復方以其多靶點、多途徑的治療優勢發揮著重要的臨床作用[2]。目前治療多以“補腎活血學說”、“經筋理論”為依據，以滋補肝腎、祛風除濕、活血通絡、循經用藥為治則[3]。本課題組通過臨床觀察發現，隨著年齡增加，人體五臟虛損的變化與OA發生有密切聯系，并運用“五臟同補”代表方五福飲對其治療，取得不錯療效[4]。為探討其可能的作用機制，以Hulth法復制KOA模型，觀察五福飲顆粒劑對KOA大鼠炎癥因子及骨形態發生蛋白（BMP-2）的影響，為“五臟同補”治療膝骨關節炎提供實驗室依據。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康SPF級雄性SD大鼠30只，體質量（220±18）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供（許可證號：SCXK（滬）2008-0016）。動物飼養于浙江中醫藥大學鼠類SPF級實驗室（合格證號：SXYK（浙）2013-0184），飼養溫度 20～23℃，濕度 50%～60%，光照每12h明暗交替，通風8～15次/h，自由飲食并保證充足的飲水，適應性飼養1周后分組實驗。

1.2 藥 物 五福飲顆粒劑：黨參、熟地、白術、當歸、甘草按 3：3：2：2：1 比例配制，五福飲顆粒劑由浙江紹興景岳堂制藥公司提供，顆粒劑1g相當于煎劑藥量5g。

1.3 試 劑 鼠白細胞介素-1β（IL-1β）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Cloud-Clone Corp公司，批號：SEA563Ra），鼠白細胞介素-6（IL-6）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Cloud-Clone Corp公司，批號SEA079Ra），廣譜二抗（上海長島生物技術有限公司，批號D-3004），辣根過氧化酶（上海長島生物技術有限公司，批號A1820），DAB濃縮型試劑盒（上海長島生物技術有限公司，批號FL-6001），中性樹脂（上海長島生物技術有限公司，批號：G8590），兔抗大鼠 BMP-2（美國 Abeam 公司，批號 ab14933）。

1.4 儀 器 超低溫冷凍儲存箱（DW-MW138，中科美菱低溫科技股份有限公司），旋渦振蕩器（K30，青浦瀘西儀器廠），生化培養箱（LRH-250A，廣州航信科學儀器有限公司），多功能酶標儀（SpectraMax M3，美國 Molecular Devices公司），正置顯微鏡（CX41，日本OLYMPUS光學工業株式會社），恒溫烘箱（DHG-9023A，上海恒一科學儀器有限公司），石蠟切片機（SQ2125，湖北徠克醫療儀器有限公司），攤片機（Ppthk21B，湖北徠克醫療儀器有限公司），IMS圖象分析系統（浙江中醫藥大學），數碼相機（D5100，日本NIKON公司），臺式高速冷凍離心機（Eppendorf-5417R，深圳市賽亞泰科儀器設備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 健康SPF級雄性大鼠30只，適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為假手術組10只和造模組20只。造模組大鼠稱重后，常規術前準備，Hulth造模法[5]建立KOA模型，取大鼠右膝內側入路，切斷內側副韌帶，剪斷前后交叉韌帶，再完整剔除內側半月板。假手術組只做切口暴露關節后縫合。術后給予青霉素4萬U肌肉注射，1天2次，連續3天。術后隨機按數字表法將造模組20只分成模型組10只和治療組10只。各組在實驗過程中未出現脫落。5只1籠進行喂養，術后1周強迫各組大鼠每天活動1小時，連續驅趕4周。

2.2 藥物干預 大鼠藥物用量換算[5]采用人和動物的體表面積計算法，人為大鼠的1/6。五福飲顆粒劑成人0.44g/（kg·d），則大鼠為2.64g/（kg·d）。治療組在造模6周后按2.64g/（kg·d）灌胃，其余各組按10mL/kg蒸餾水灌胃，1天1次，灌胃4周。

2.3 ELISA法檢測各組大鼠血清及關節液IL-1β和IL-6濃度 各組藥物干預結束1周后，用2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉成功后，腹主動脈取血5～10mL置于抗凝管內，靜置30min后，放入3000r/min的離心機，離心15min取血清。處死大鼠立即切取各組大鼠右膝關節，打開關節囊，用2mL生理鹽水沖洗關節腔，取約2cm直徑10mL一次性無菌尿杯，上置0.25μm一次性過濾器收集關節沖洗液，移液器轉移至2.5mL EP管，離心5min，取上清液約1mL。指標測定按照ELISA檢測試劑盒說明書進行。在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一和第二孔中分別滴加標準品100μL，接著加標準品稀釋液50μL，混勻；然后從第一孔和第二孔中各取100μL分別加到第三、四孔，以此類推至第九、十孔，混勻后從第九、十孔中各取50μL棄掉。在酶標包被板待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再滴加待測樣品10μL（樣品最終稀釋濃度為5倍）。將樣品滴加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻（空白對照孔不加樣品及酶標試劑）。用封板膜封板后置37℃溫育30min，洗滌5次，每孔加入酶標試劑50μL，再溫育，洗滌，顯色，在酶標儀上于450nm波長處以陰性對照孔調零，檢測各孔光密度（OD）值，根據標準液的檢測結果得出標準曲線，求出各組樣品的實際濃度。

2.4 免疫組化檢測大鼠關節軟骨BMP-2表達情況關節液收集完后立即用4%中性多聚甲醛固定膝關節標本48h，接著用10%EDTA-2Na對標本脫鈣4周，當大頭針可以無阻力穿透標本時確認脫鈣成功，修剪標本，脫水、石蠟包埋后，右側股骨內側髁矢狀面切片，二甲苯脫蠟；梯度乙醇脫水；復合抗原修復液（0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液），50℃孵育15min；3%H2O2中室溫孵育10min；含1%牛血清白蛋白（BSA）抗體稀釋液稀釋的一抗BMP-2（1∶200），陰性對照以PBS代替一抗，4℃孵育過夜；滴加辣根過氧化酶標記廣譜二抗工作液，37℃孵育30min；DAB顯色；蘇木精復染；二甲苯透明，封片，拍片。在400倍鏡下每份樣本隨機選取5個視野，獲取圖像并編號、存盤。骨形態發生蛋白-2（BMP-2）免疫組化染色陽性結果呈棕黃色，在胞漿表達，主要分布于關節軟骨中層和深層。采用Image-Pro Plus軟件，計算陽性染色平均光密度值。

2.5 統計學方法應用SPSS20.0軟件統計分析。數據以（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析組間差異，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Tamhane’s T2法，若不滿足正態性時采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠血清及關節液IL-1β和IL-6濃度比較 與假手術組比，模型組和治療組血清及關節液中IL-1β和IL-6的濃度均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，治療組血清及關節液中IL-1β和IL-6的濃度均有顯著下降（P＜0.01），見表 1～2。

3.2 各組大鼠關節軟骨細胞BMP-2表達比較 模型組軟骨中BMP-2表達水平低于假手術組（P＜0.01），使用五福飲顆粒劑治療后，治療組表達比模型組明顯升高（P＜0.01），與假手術組無明顯差異（P＞0.05）見封二圖 1、2。

4 討論

KOA 歸屬于中醫“痹癥”、“骨痹”、“膝痹”、“痿證”或“痿痹”等范疇，病機為本虛標實，肝腎不足、正氣虧虛是其本，風寒濕邪入侵，痰濁內蘊，瘀血阻滯經絡為其標，即“本痿標痹”[6]。KOA是一種退行性病變，其患病率隨著年齡的增長明顯升高，且在診斷標準中明確指出“中老年患者（＞40歲）”為診斷成立的條件之一。可見，增齡衰老是KOA較為確切的發病危險因素。中醫認為該病多見于中老年以后，肝氣衰，筋不能動，進而腎臟衰，形體皆極。臨床多見筋急而攣，膝軟活動不利，或痿軟而肌力減退等，因而認為其病機為“本痿”。“痿證”是肢體筋脈弛緩，手足痿軟無力，肌肉萎縮，不能隨意運動的一種病癥。陳無擇指出“人身有皮毛、血脈、筋膜、肌肉、骨髓，以成其形，內則有肝、心、脾、肺、腎以主之，若隨情妄用，喜怒勞佚，以致內臟精血虛耗，使血脈、筋骨、肌肉痿弱無力以運動，故致痿躄，狀與柔風腳氣相類。柔風腳氣，皆外因風寒，正氣與邪氣相搏，故作腫苦痛，為邪實；痿由內臟不足之所致，但不任用，亦無痛楚，此血氣之虛也”，強調痿乃內臟不足，血氣之虛所致。故五臟虛損，血氣空虛，不榮四末為“痿”病機。中醫強調治病求本，故而提出“五臟同補”治療KOA的觀點。

表1 各組大鼠血清IL-1β和IL-6濃度比較（μg/L，x±s）

表2 各組大鼠關節液IL-1β和IL-6濃度比較（μg/L，x±s）

五臟同補的整體觀，源于五行五藏、五臟互藏理論。五行五藏，是指五行中的任何一行包括其他四行。張景岳五行五藏的觀點，將五行與陰陽緊密結合起來，提出“五行即陰陽之質，陰陽即五行之氣，氣非質不力，質非氣不行”（《類經圖翼·運氣·五行統論》），將五行與五臟結合起來，即形成了五臟互藏理論[4]。《景岳全書·卷六·脈神章》曰：“凡五臟之氣必互相灌溉，故五臟之中，必各兼五氣。”同時又指出：“有一臟之偏強，常致欺凌他臟者；有一臟之偏弱；每因受制多虞者。”（《景岳全書·卷二·傳忠錄·臟象別論》）五福飲為明代著名醫家張景岳創制的五臟同補代表方名方，見于《景岳全書·新方八陣·補陣》，由人參、熟地黃、當歸、白術、炙甘草組成，主治五臟氣血虧損，其中人參補氣、養心、養神、生津；熟地質潤入腎，為補腎陰之要藥；當歸補血、活血、養肝；白術益氣、健脾、補肺；炙甘草和中補脾、潤肺、解毒、調和諸藥。五藥同用，共奏補益五臟氣血之功。實驗中人參用黨參代替，黨參具有補氣、養血之效。張景岳稱“凡五臟氣血虧損者，此能兼治之，足稱王道之最”。

白細胞介素-1（IL-1）家族主要包括IL-1α和IL-1β 兩種亞型，以 IL-1β 為主。研究[7]表明，IL-1β在OA患者關節液呈高水平表達，且與關節軟骨損傷成正相關。其可影響軟骨細胞基因的表達抑制軟骨的合成代謝[8-9]，同時通過誘導基質金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達與活化，促進軟骨細胞的分解代謝[10]。IL-1β可刺激軟骨細胞產生大量NO[11]，通過caspase-8、P38及ERK1/2途徑誘導軟骨細胞凋亡[12]。此外還可上調促進軟骨細胞衰老的Caveolin-1 mRNA和蛋白質水平，加速OA進程[13]。因此，IL-1β被認為是OA病理過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的最重要細胞因子[14]。白細胞介素-6（IL-6）是另一種重要的炎癥介質，正常軟骨細胞可產生少量IL-6，高水平時可使軟骨及軟骨下骨結構改變，刺激軟骨細胞增殖，導致骨贅形成[15]。研究[16]證實，IL-6可刺激滑膜增生，激活破骨細胞，形成滑膜血管翳及釋放MMPs，從而誘導關節和軟骨的破壞。其可與IL-1協同抑制軟骨細胞合成蛋白聚糖，導致軟骨基質缺失[17]。

BMP-2是轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）超家族成員，是正常胚胎期骨組織及成年期骨修復中的重要蛋白分子[18]。研究[19]表明，BMP-2可刺激軟骨蛋白多糖的合成、誘導蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達，誘導間充質干細胞向軟骨細胞分化，調節新生軟骨細胞表型，使新生軟骨內的蛋白多糖和膠原纖維含量更趨近正常[20]，同時可長期維持體外培養的軟骨細胞表型，加速全層關節軟骨修復，改善修復軟骨組織質量[21]。有學者研究[22]認為，BMP-2與骨贅的形成有關，但體外給予不同劑量BMP-2導致骨關節炎骨贅的研究表明了其導致骨贅的作用是有限的[23]。

本實驗表明，使用五福飲顆粒劑可降低KOA大鼠血清和關節液 IL-1β、IL-6 含量（P＜0.01），減輕炎癥反應，同時上調關節軟骨中BMP-2表達（P＜0.01），促進關節軟骨修復，從而延緩KOA進程（P＜0.01）。本實驗存在樣本量少，觀察周期短，未對劑量探討的不足，將在下一步的研究中改進。

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