脂聯(lián)素基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征的相關(guān)性研究

林峰芳孫 霞 張玲云

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種多基因遺傳病，國內(nèi)外學(xué)者針對其遺傳特點(diǎn)展開了大量研究，但是并未發(fā)現(xiàn)有與PCOS發(fā)病直接相關(guān)的基因[1-2]。近年來脂聯(lián)素基因（ADIPOQ）與PCOS的相關(guān)性成為研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ADIPOQ單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)包括rs1501299和rs2241766[3]，研究[4]顯示這兩個多態(tài)性位點(diǎn)與糖尿病、心血管疾病、肥胖等相關(guān)，也有研究[5]顯示這兩個多態(tài)性位點(diǎn)與PCOS相關(guān)，但尚存爭議。另外有報道[6]稱ADIPOQ的另兩個多態(tài)性位點(diǎn)rs17300539和rs12495941與脂聯(lián)素水平有關(guān)，但鮮有其與PCOS的相關(guān)性報道。本研究通過分析PCOS患者與不孕不育對照組患者 ADIPOQ的 rs17300539、rs1501299、rs2241766、rs12495941四個單核苷酸多肽位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布的差異探討ADIPOQ多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性，為研究PCOS的發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選擇2012年3月—2016年10月奉化區(qū)婦幼保健院收治的多囊卵巢綜合征患者65例，平均年齡（27.85±4.18）歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI）（25.45±3.87）kg/m2。多囊卵巢綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：（1）偶發(fā)排卵或者沒有排卵；（2）臨床生化指標(biāo)顯示雄激素過多癥；（3）卵巢多囊樣改變：B超檢查顯示卵巢體積增加10mL以上，至少有一側(cè)的卵巢的直徑在2～9mm卵泡在12個以上。另外根據(jù)研究組患者的年齡、BMI等隨機(jī)選擇同期在我院就診的不孕不育患者60例作為對照組，平均年齡（27.79±6.25）歲，BMI（25.41±4.13）kg/m2。該組患者主要是由于男方因素或者輸卵管因素導(dǎo)致不孕。兩患者年齡、民族、BMI等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。排除標(biāo)準(zhǔn)：有分泌雄激素腫瘤；先天腎上腺皮質(zhì)增生；Cushing綜合征；有吸煙、酗酒等不良習(xí)慣的患者；有甲狀腺疾病、高血壓、心血管疾病、糖尿病等患者；近半年內(nèi)服用過避孕藥、促排卵藥物、雄激素藥物、糖皮質(zhì)激素、高血壓藥物等的患者。本研究獲得了奉化區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，每位參與研究的患者均簽署了知情同意書。

1.2 方 法 采集所有研究對象的空腹靜脈血約4mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用全血基因組抽提試劑盒抽提基因組DNA，試劑盒為QIAamp DNA抽提試劑盒（Qiagen，編號51183），抽提后使用50μLddH2O洗脫。PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因位點(diǎn)，rs17300539位點(diǎn)設(shè)計的引物序列（軟件為Primer Premier 6.0）為：上游 5’-ACTCTGCTGAGATGGACG GA-3’；下游上游 5’-GGGATGAGGGTGAAGATGG G-3’。rs1501299位點(diǎn)設(shè)計的引物序列為：上游5’-GGCCTCTTTCATCACAGACC-3’；下游上游5’-AGA TGCAGCAAAGCCAAAGT-3’。rs2241766 位點(diǎn)設(shè)計的引物序列為：上游5’-GAAGTAGACTCTGCTGAGAT GG-3’；下游上游 5’-TATCAGTGTAGGAGGTCTGTG ATG-3’。rs12495941位點(diǎn)設(shè)計的引物為：上游5’-T AGTGAGCCGAGATTGTGC-3’；下游 5’-TCCTTAGG CATGTAGCTTTCC—3’。PCR 擴(kuò) 增體系為：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）5μL，dNTP mix 5μL，上下游引物各 1μL，TaKaRa LA Taq（5U/μL）0.5μL，模板 DNA2μL，ddH2O35.5μL，總體積 50μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃，5min；94℃，30sec；60℃（rs2241766）或者 58℃（rs17300539、rs1501299、rs12495941），30sec；72℃，45sec；35個循環(huán)后 72℃延伸 10min。將 PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物純化后送上海桑尼生物科技有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果判定等位基因和基因型情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件，計數(shù)資料表示方法為[n（%）]，采用 χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用 Logistic 回歸分析基因型的OR值，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs17300539位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

研究組和對照組rs17300539位點(diǎn)基因型之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.85；P=0.03），且研究組患者rs17300539位點(diǎn)A等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.38；P=0.04），rs17300539 位點(diǎn)AA基因型患者PCOS的風(fēng)險顯著高于GG基因型（OR=3.15，P=0.00），見表 1。

2.2 rs1501299位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較

研究組和對照組rs1501299位點(diǎn)基因型之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.75；P=0.02），且研究組患者rs1501299位點(diǎn)C等位基因頻率明顯高于對照組，A等位基因頻率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.38；P=0.04），rs1501299 位點(diǎn) CC 基因型患者PCOS的風(fēng)險顯著高于AA基因型（OR=2.75，P=0.01），詳見表 2。

2.3 rs2241766位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較研究組和對照組rs2241766位點(diǎn)基因型之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組rs2241766位點(diǎn)T等位基因和G等位基因頻率之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

2.4 rs12495941位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的比較

研究組和對照組rs12495941位點(diǎn)基因型之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組rs12495941位點(diǎn)G等位基因和T等位基因頻率之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 4。

3 討論

PCOS是由多個基因控制的遺傳病，能夠影響機(jī)體組織、細(xì)胞的功能，嚴(yán)重影響患者的生命健康，研究PCOS的遺傳學(xué)特性成為學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，主要是一些參與調(diào)控生育的基因與PCOS的發(fā)病相關(guān)，例如與促性腺激素有關(guān)的基因等[9]。另外，臨床研究[10-11]顯示，由于與PCOS的發(fā)病相關(guān)的基因具有多態(tài)性，因而其臨床表現(xiàn)也呈現(xiàn)多樣性。近年來關(guān)于ADIPOQ基因多態(tài)性位點(diǎn)的研究也成為熱點(diǎn)之一，這其中以 rs17300539、rs1501299、rs2241766、rs12495941四個單核苷酸多肽位點(diǎn)為主，但是由于受到人種、地域的差異以及樣本量的影響，研究結(jié)果并不一致[12-13]。

3.1 rs17300539位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs17300 539位點(diǎn)位于ADIPOQ基因的啟動子區(qū)域，相關(guān)研究顯示該區(qū)域主要與高血壓、糖尿病等相關(guān)疾病的發(fā)病有關(guān)[12]。有研究[14]顯示，rs17300539基因位點(diǎn)與肥胖的發(fā)生相關(guān)，研究[15]顯示rs17300539與胰島素的分泌水平和血清脂聯(lián)素的分泌水平相關(guān)，從本研究結(jié)果中可以看出，研究組患者rs17300539位點(diǎn)A等位基因頻率明顯高于對照組（P＜0.05），rs17300539位點(diǎn)AA基因型患者PCOS的風(fēng)險顯著高于GG基因型（P＜0.05），由此 rs17300539與 PCOS的發(fā)生具有相關(guān)性。

表1 rs17300539位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表2 rs1501299位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表3 rs2241766位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表4 rs12495941位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

3.2 rs1501299位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs1501 299位點(diǎn)在ADIPOQ基因上位于第二個內(nèi)含子，據(jù)相關(guān)對韓國PCOS患者的研究顯示其與PCOS有相關(guān)性[16]，但是據(jù)相關(guān)研究顯示該位點(diǎn)與伊朗人的PCOS的發(fā)病并無相關(guān)性[17]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者rs1501299位點(diǎn)C等位基因頻率明顯高于對照組，A等位基因頻率明顯低于對照組（P＜0.05），rs1501299位點(diǎn)CC基因型患者PCOS的風(fēng)險顯著高于AA基因型（P＜0.05），說明 rs1501299位點(diǎn)與 PCOS的發(fā)生具有相關(guān)性。

3.3 rs2241766位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs2241 766位點(diǎn)位于ADIPOQ基因的第二個外顯子區(qū)域，該位點(diǎn)與PCOS的相關(guān)性具有一定的爭議，有研究[18]顯示其與PCOS的發(fā)病關(guān)系密切，也有研究[5]顯示其與PCOS的發(fā)生并無顯著相關(guān)性，本研究結(jié)果可以看出研究組和對照組rs2241766位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），分析原因可能是該位點(diǎn)與PCOS的相關(guān)性受人種、地域和樣本量等因素影響。

3.4 rs12495941位點(diǎn)與PCOS相關(guān)性分析 rs12495 941位點(diǎn)分布于ADIPOQ基因的第一個內(nèi)含子區(qū)域，針對該位點(diǎn)的研究目前較少，且研究多針對該位點(diǎn)與糖尿病或者心血管疾病相關(guān)，有研究[15]顯示該位點(diǎn)與PCOS的發(fā)病并不相關(guān)，本研究結(jié)果顯示研究組和對照組rs12495941位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布之間的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），由此可以看出rs12495941位點(diǎn)與PCOS的發(fā)病并不相關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果[5]一致。然而本次研究受客觀條件的限制導(dǎo)致樣本量比較小，并沒有區(qū)分患者的民族差異等因素，因此可能對研究結(jié)果造成一定的影響，有必要增加樣本量和區(qū)分不同民族患者，以深度分析其內(nèi)在相關(guān)性。

綜上所述，rs17300539位點(diǎn)與rs1501299位點(diǎn)可能是多囊卵巢綜合征的易感基因位點(diǎn)，但是還需要進(jìn)一步研究數(shù)據(jù)支持。

［1］Lambrinoudaki I.Cardiovascular risk in postmenopausal women with the polycystic ovary syndrome［J］.Reproductive Sciences，2015，68（3）：13.

［2］徐曉航，陳圓輝，王倩，等.多囊卵巢綜合征診治新進(jìn)展［J］.國際生殖健康/計劃生育雜志，2015，34（2）：160-164.

［3］王凱風(fēng)，葉萍，王丹，等.ADIPOQ基因11377C/G位點(diǎn)多態(tài)性與身體活動對兒童代謝綜合征的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（23）：3853-3856.

［4］索樹珍，隋小芳，李雪杰，等.UCP2-866G/A和ADIPOQ+45T/G基因多態(tài)性的交互作用與2型糖尿病合并冠心病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（12）：2258-2263.

［5］張文娟，吳興國，丁明德，等.脂聯(lián)素基因多態(tài)性與多囊卵巢綜合征發(fā)病關(guān)系的病例對照研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2015，50（11）：825-829.

［6］ Zhang G，Gu C，Zhu Y，et al.ADIPOQ polymorphism rs18 2052 is associated with clear cell renal cell carcinoma［J］.Cancer Science，2015，106（6）：687.

［7］ Legro RS，Arslanian SA，Ehrmann DA，et al.Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome：an Endocrine Society clinical practice guideline［J］.Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，2013，98（12）：4565.

［8］ Amato MC，Vesco R，Vigneri E，et al.Hyperinsulinism and polycystic ovary syndrome（PCOS）：role of insulin clearance［J］.Journal of Endocrinological Investigation，2015，38（12）：1319-1326.

［9］ Sarkar C，Maitra A.Deciphering the cis-regulatory elements of co-expressed genes in PCOS by in silico analysis［J］.Gene，2015，408（1-2）：72.

［10］ Bayram B，Kilicci C，Onlü H，et al.Association of angiotensin converting enzyme（ACE）gene I/D polymorphism and polycystic ovary syndrome（PCOS）［J］.Gene，2011，489（2）：86-88.

［11］Guruvaiah P，Govatati S，Reddy TV，et al.Analysis of Connexin37 gene C1019T polymorphism and PCOS susceptibility in South Indian population：case-control study［J］.European Journal of Obstetrics&Gynecology&Reproductive Biology，2015，196（231）：17-20.

［12］Sun Y，Li DG，Li Q，et al.Relationship between adipoq gene polymorphism and lipid levels and diabetes［J］.Journal of Biological Regulators&Homeostatic Agents，2015，29（1）：211-227.

［13］ Zhang GM，Gu CY，Zhu Y，et al.864 ADIPOQ gene polymorphism is associated with clear cell renal cell carcinoma［J］.European Urology Supplements，2015，14（2）：e553.

［14］ Morandi A，Maffeis C，Lobbens S，et al.Early detrimental metabolic outcomes of rs17300539-A allele of ADIPOQ gene despite higher adiponectinemia［J］.Obesity，2010，18（7）：1469.

［15］ Sun X，Wu X，Duan Y，et al.Family-Based Association Study of rs17300539 and rs12495941 Polymorphism in Adiponectin Gene and Polycystic Ovary Syndrome in a Chinese Population［J］.Medical Science Monitor International Medical Journal of Experimental&Clinical Research，2017，23（28）：78-84.

［16］Li L，Yun JH，Lee JH，et al.Association study of+45G15G（T/G）and+276（G/T）polymorphisms in the adiponectin gene in patients with polycystic ovary syndrome［J］.International Journal of Molecular Medicine，2011，27（2）：283-287.

［17］ Ranjzad F，Mahmoudi T，Irani SA，et al.A common variant in the adiponectin gene and polycystic ovary syndrome risk［J］.Molecular Biology Reports，2012，39（3）：2313-2319.

［18］Zhou W，Liu Y，Zhong DW.Adiponectin（ADIPOQ）rs22 41766 G/T polymorphism is associated with risk of cancer：evidence from a meta-analysis［J］.Tumor Biology，2013，34（1）：493-504.