親和雙水相膠束系統的相行為及其應用

劉 耀， 周鑫鑫， 鄧 剛

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

雙水相膠束系統(aqueous two-phase micellar system，ATPMS)是一種生物化學領域的液液萃取技術，因其具有生物相容性好、可調節因素多、對膜蛋白增溶效果好等優點而備受關注[1-2].在這個系統中，表面活性劑水溶液在一定條件下會自發分離成互不相溶的膠束富集相與膠束缺失相，利用兩相間物理化學性質的差異，根據體積排阻效應、靜電相互作用和疏水相互作用等的不同，實現不同生物分子的分離[3].自1981年Bordier[4]使用表面活性劑Triton X-114(TX)構成的雙水相系統，首次實現兩親性內膜蛋白與親水蛋白的分離后，雙水相膠束系統就被成功應用于蛋白質[5-7]、抗生素[8]和DNA[9]等多種生物分子的萃取.近年來,更多的研究集中在雙水相膠束系統中引入親和配基以提高萃取的回收率和特異性.如Garg等[10]在TX上偶聯色素形成一種親和表面活性劑對乳酸脫氫酶的分離；Lam等[11]利用非離子型表面活性劑C10G1與CBM9標簽間的親和作用，對帶有CBM9標簽的綠色熒光蛋白GFP進行分配；Wang等[12]初步探索由TX螯合鎳離子與TX構成的親和雙水相膠束系統對富組氨酸標簽蛋白EGFP的萃取效果等.

(a)HM-EO

(b)TX-Cu(Ⅱ)

在疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)形成的一元膠束系統中進行實驗[13-14]，引入帶有親和配基的小分子表面活性劑Triton X-114-IDA-Cu(Ⅱ)(TX-Cu(Ⅱ))，構建新型的親和雙水相混合膠束系統HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)(見圖1).考察了親和表面活性劑加入量、溫度、pH、鹽離子濃度及種類對新系統液液相平衡性質的影響.并以重組蛋白3′,5′-二磷酸核苷酸酶為模型蛋白，研究新系統對富組氨酸蛋白的萃取選擇性效果，為其實際應用提供基礎依據.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)購于瑞典Akzo Nobel Surface Chemistry AB公司，分子量約為55.8 kD；Triton X-114購于上海生工生物工程有限公司；亞氨基二乙酸(IDA)購自國藥集團化學試劑有限公司；3′,5′-二磷酸核苷酸酶，實驗室參照Yang等[15]方法表達及純化.其他試劑均為市售分析純.

Cary 4000紫外分光光度計(美國安捷倫科技有限公司)；FE20型pH計(上海梅特勒-托利多有限公司)；DDS-307電導率儀(上海精密科學儀器有限公司)；BSA224S電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；DZF-6050B真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司).

1.2 TX-Cu(Ⅱ)的合成

TX-Cu(Ⅱ)合成方法見參考文獻[16].首先，以TX為載體，通過環氧氯丙烷(ECH)法進行羥基活化；然后TX-環氧化物在堿性條件下偶聯亞氨基二乙酸(IDA)，經氯仿萃取并真空干燥處理，合成得到TX-IDA；最后將TX-IDA與銅離子螯合，經再次萃取得到TX-Cu(Ⅱ).

1.3 雙水相相圖測定

用PBS緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)配制質量濃度均為10%的HM-EO與TX-Cu(Ⅱ)母液.按不同配比混合兩種母液，加入適量緩沖液，配制成總質量5 g的雙水相體系，其中HM-EO質量分數均為2.5%，TX-Cu(Ⅱ)質量分數分別為0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%.體系混合均勻，于10 ℃水浴中恒溫靜置24～48 h分相.測定上相與下相體積，并分別取樣測定HM-EO含量.

HM-EO濃度測定[17]：稱取一定量的待測樣品，加入等量丙酮，并用質量比為1∶1的丙酮-水溶液稀釋.取0.5 g稀釋液，加入5 mL考馬斯亮藍G250試劑，靜置30 min，620 nm處測吸光值，由標準曲線得到HM-EO濃度.利用稱重法(真空干燥法)求得上下相中水的含量，質量衡算得到兩相中TX-Cu(Ⅱ)含量，進而繪制相圖描述雙水相膠束系統的相行為.實驗重復3次，取平均值.

1.4 模型蛋白親和分配

YND用PBS緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)配制成2.5 mg/mL母液.取2 mL母液加入到不同配比的HM-EO與TX-Cu(Ⅱ)混合溶液中，配制成5 g的ATPMS，其中HM-EO質量分數為2.5%，TX-Cu(Ⅱ)質量分數從0.00%～0.15%變化.混合均勻，1 000 r/min離心5 min后于10 ℃水浴中恒溫靜置5 h分相.取樣分析上下相中YND的酶活以及總蛋白含量.

YND活性根據PAP水解作用中NADH的消耗測定[15].酶活力單位(U)定義為特定條件下(4 ℃，pH 8.0)，每min可以氧化1 μmol NADH所需的酶量.總蛋白濃度采用Lowry法[18]，以BSA標準品制作標準曲線.分配系數Ke表示系統上相與下相中酶濃度的比值；Yt與Yb分別為上下相的酶活回收率(%).

2 結 果

2.1 雙水相膠束系統相圖

新構建的雙水相膠束系統中，HM-EO是一個嵌段共聚物，親水的聚氧乙烯鏈上帶有表面活性基團，能與合成的親和表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)形成混合膠束[13].圖2為2.5%的HM-EO與不同濃度TX-Cu(Ⅱ)形成的雙水相膠束系統.圖2顯示，HM-EO與TX-Cu(Ⅱ)的配比顯著影響了新雙水相系統的成相穩定性，隨著TX-Cu(Ⅱ)濃度的增加，兩相間的雙結線長度逐漸變短，表明體系由兩相趨于均相.TX-Cu(Ⅱ)濃度在0.0%～0.6%時，系統中TX-Cu(Ⅱ)主要分配在下相，與HM-EO形成帶親和配基的混合膠束；隨著TX-Cu(Ⅱ)含量的增加，下相中由高分子聚氧乙烯HM-EO形成的空間網狀結構逐漸崩潰，相分離更加困難；在TX-Cu(Ⅱ)濃度高于1.0%以后，系統趨于均相，TX-Cu(Ⅱ)可能更多地以單膠束的形式存在.

圖2 HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖

2.2 溫度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖的影響

圖3顯示，隨著溫度的升高，系統的兩相區域(共存曲線之間的區域)逐漸變大，表明升高溫度有利于系統的分相.系統溫度升高會破壞HM-EO聚氧乙烯鏈與水分子之間的氫鍵結合，促進水分子從下相自發轉移至上相，增加聚合物在下相的濃度，從而有利于膠束之間網狀結構的形成[19-20].另外，分子熱運動加劇，帶親和配基的小分子表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)更易插入到HM-EO網狀結構中形成混合膠束，對新構建系統的穩定有利.在本研究中，由于主成相劑HM-EO的分子量較大、濁點低，因此，系統中加入一定比例TX-Cu(Ⅱ)所構成的HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統在較低的溫度下(4 ℃)可以穩定快速分相[14-21]，并且上下相的水含量均超過90%，適合用于對生物活性物質的萃取.

圖3 HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統在不同溫度下的相圖

2.3 pH對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖的影響

實驗考察pH對系統相圖的影響，結果如圖4所示.隨著pH值的降低，兩相區域逐漸變大，上相HM-EO膠束濃度減少，下相膠束濃度增大，表明新構建的ATPMS在酸性環境更容易分相.表1顯示，TX-Cu(Ⅱ)在下相的含量隨著溶液pH值降低逐漸增大，HM-EO與帶親和配基的小分子表面活性劑可以形成更加穩定的雙水相膠束系統.由于溶液的pH會顯著影響蛋白質分子的電性及所帶電荷數，所以可以調節蛋白質在系統中的分配系數[22]。因此，選擇合適的pH對該雙水相體系用于蛋白質的分配具有潛在的研究價值.

圖4 溶液pH對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖的影響

pHw(TX-Cu(Ⅱ))/%0.00.20.40.60.81.030.000.350.670.901.111.2350.000.320.640.871.071.2170.000.300.580.800.991.1690.000.250.450.710.901.09110.000.220.440.650.881.06

2.4 無機鹽濃度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖的影響

無機鹽雖然不是成相的必需組分，但是在應用雙水相膠束系統分離生物物質時，系統中通常會存在一定濃度的無機鹽，鹽濃度對相平衡性質會產生一定的影響.另外，鹽濃度發生微小變化即可顯著影響生物分子的分配[19]，因此，在實際應用雙水相膠束系統之前，需先了解無機鹽對相行為及分配行為的影響.圖5考察不同鹽濃度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相平衡的影響，結果顯示，隨著NaCl濃度的增大，系統兩相區域逐漸增大.一方面，添加鹽離子可以壓縮混合膠束擴散雙電層，膠束網狀結構收縮并在下相聚集.另一方面，無機鹽的加入引起反離子靜電屏蔽作用的增強[19]，膠束帶電聚集體離子頭基間的距離縮短，膠束間斥力減弱，小分子表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)更容易進入下相與HM-EO形成混合膠束(見表2).因此，通過增加鹽濃度，有利于混合膠束網絡的形成，促進新構建系統的成相與穩定.

圖5 NaCl濃度對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖的影響

表2 NaCl濃度對不同質量分數TX-Cu(Ⅱ)在下相含量的影響

n(NaCl)/mMw(TX-Cu(Ⅱ))/%0.00.20.40.60.81.000.000.300.580.800.991.16500.000.340.630.861.051.191000.000.340.690.891.111.301500.000.390.740.921.151.38

2.5 不同種類鹽離子對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖的影響

圖7為陽離子對系統相圖的影響.通過對比圖7(a)和圖7(b)常見的氯化鹽及溴化鹽，結果表明，K+在促進系統分相效果上略優于Na+.一般地，陽離子加入系統后，能夠自發地與聚氧乙烯鏈相結合(熵增加過程)而使其“脫水”，這種去溶劑化效應有利于系統分相，隨著結合位點逐漸接近飽和，熵不再增加，系統達到相平衡.在一定濃度范圍內，與Na+相比，K+更易與聚氧乙烯鏈結合而達到飽和，因而，添加有K+的系統存在較大的兩相區域[24].

圖6 不同種類陰離子對HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統相圖的影響

(a)氯化鹽

(b)溴化鹽

2.6 YND在HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統中的親和分配

在模型蛋白分配實驗中，重組蛋白YND帶有六聚組氨酸標簽.圖8顯示，系統中不含TX-Cu(Ⅱ)時，YND主要分配于上相(Ke=1.681)，但是TX-Cu(Ⅱ)的存在可以改變YND分配行為，使其從傾向于分配到上相轉為更易分配于下相.并且，隨著TX-Cu(Ⅱ)在系統中含量的增加，ATPMS萃取分離的選擇性增強，Ke在TX-Cu(Ⅱ)濃度為0.150%時降至0.153%，表明TX-Cu(Ⅱ)在富組氨酸蛋白分配中具有高的親和結合效率.酶活回收代表分配過程中酶活性損失的程度.圖8還顯示，TX-Cu(Ⅱ)濃度在0.00%～0.15%時，YND酶活回收率總和下降小于2.60%，TX-Cu(Ⅱ)對酶活影響不大，這與Wang等[12]的研究結論相一致.因此，實驗構建的HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統可以有效用于對富組氨酸蛋白YND的分離純化.

圖8 TX-Cu(Ⅱ)濃度對YND分配的影響

3 討 論

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