漢防己甲素對鈦顆粒誘導PBMC免疫成熟的影響

田節印，趙麗

（邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002）

0 引言

隨著我國進入老齡化社會，骨性關節炎的發病逐年增高，而目前骨關節炎的有效手段仍是人工關節置換術[1]，盡管人工關節的材質及設計一直不斷在改進，但假體無菌松動仍是影響人工關節使用壽命的最主要原因之一[2-3]，而且發病率居高不下。漢防己甲素是一種雙芐基異喹啉生物堿，具有抗炎、抗高血壓及抗腫瘤等作用，已廣泛應用于臨床各個疾病的治療[4-5]。我們選擇觀察漢防己甲素對鈦金屬顆粒刺激PBMC釋放IL-12和干擾素-g的情況作為研究對象，探討漢防己甲素對鈦顆粒誘導PBMC免疫成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康志愿者采集肘靜脈血，肝素抗凝。采用Ficoll密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞（PBMC）。淋巴細胞分離液，10%小牛血清RPMI1640，Hank's液，鈦顆粒（Alfa Aesar公司），IL-12、INF-g酶聯免疫吸附劑測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、漢防己甲素（臨汾藥業有限公司）。

1.2 實驗儀器

DHC-1300-RA-BR超凈工作臺（蘇州凈化公司），PCR儀（BD公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

1組為陰性對照組，PBMC+培養基；2組為空白對照組，PBMC+生理鹽水；3組陽性對照組，PBMC+0.1%鈦顆粒；4組為漢防己甲素組，分離PBMC+0.1%鈦顆粒+1g/mL漢防己甲素。

1.3.2 細胞分離及活力檢測

將采用Ficoll密度梯度離心法獲得的外周血單個核細胞加入5倍以上體積的Hank￠s液，1500rpm×10min，洗滌細胞兩次，末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重懸細胞，取一滴細胞懸液與一滴0.2%臺盼藍染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數計細胞活力檢測，活細胞百分率在95%以上。

1.3.3 鈦顆粒懸液配制

將鈦顆粒用乙醇浸泡消毒后，用無菌PBS配成濃度為0.1%的懸液，用鱟試劑證實無內毒素后儲存在4℃冰箱備用。

1.3.4 培養上清液中的IL-12和干擾素-g水平檢測

采用雙抗夾心ELISA法，檢測各組上清液標本中IL-12、INF-g水平，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS13.0軟件對所得數據進行統計分析，各組上清液標本中IL-12、INF-g含量的組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

ELISA法檢測培養上清液中的細胞因子顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，促炎細胞因子IL-12和干擾素-g的量明顯增多（P＜0.05），而陰性對照組和空白對照組的IL-12和INF-g的表達無明顯變化（P＞0.05）；經漢防己甲素干預后，與3組相比，可顯著降低培養上清液中的炎性細胞因子IL-12和INF-g的含量（P＜0.05），見表 1。

表1 各組對PBMC表達IL-12及INF-g的影響

表1 各組對PBMC表達IL-12及INF-g的影響

與1組相比，*P＜0.05；與3組相比，…P＜0.05。

25.85±2.73 30.59±11.63 86.49±14.04*57.26±6.84…組別 IL-12含量（pg/mL） INF-g含量（pg/mL）1組2組3組4組13.55±0.56 14.02±0.03 23.16±0.12*19.23±0.01…

3 討論

研究表明，人工假體磨損顆粒釋放的金屬離子刺激假體周圍界膜中的細胞而釋放出大量炎癥因子[6]，影響免疫細胞如單核巨噬細胞、淋巴細胞等的功能參與假體周圍骨溶解導致假體的無菌性松動。根據研究結果，理論上可以選擇抑制免疫細胞功能的藥物來預防無菌性松動。漢防己甲素是雙芐基異喹啉類生物堿，具有廣泛的藥理作用。已有研究表明漢防己甲素可降低炎癥因子的表達[7]。本研究通過體外觀察鈦顆粒對PBMC表達免疫炎性因子IL-12、INF-g的情況及漢防己甲素對其影響，探討漢防己甲素預防人工關節無菌松動的可能。

研究結果顯示與陰性對照組和空白對照組相比，促炎細胞因子IL-12和干擾素-g的量明顯增多（P＜0.05），而陰性對照組和空白對照組的IL-12和INF-g的表達無明顯變化（P＞0.05）；經漢防己甲素干預后，與3組相比，可顯著降低培養上清液中的炎性細胞因子IL-12和INF-g的含量（P＜0.05）。提示鈦顆粒確可作為刺激因子促進免疫炎性細胞PBMC的成熟，并釋放大量炎性因子IL-12和INF-g，影響關節松動的發生；漢防己甲素可通過抑制免疫炎性細胞成熟，抑制釋放炎性因子，從而預防關節松動的形成。

[1] Ingham E, Fisher J. The role of macrophages in osteolysis of total joint replacement.[J]. Biomaterials, 2005,26(11)：1271-1286.

[2] Bozic KJ, Kurtz SM, Lau E, et al. The Epidemiology of Revision Total Hip Arthroplasty in the United States[J]. Clinical Orthopaedics& Related Research?, 2009,91(1)：128-133.

[3] 曹金.漢防己甲素的臨床應用進展[J].世界臨床藥物 ,2013,11(3)：12.

[4] 牟章兵.漢防己甲素對離體兔角膜基質細胞抑制機制的實驗研究[J].眼科研究 ,2007,1(8)：160.

[5] 王國彧.漢防己甲素治療類風濕關節炎的臨床研究[J].中醫藥信息 ,2014,6(24)：40.

[6] Goodman SB, Huie P, Song Y, et al. Cellular profile and cytokine production at prosthetic interfaces. Study of tissues retrieved from revised hip and knee replacements.[J]. Journal of Bone & Joint Surgery British Volume, 1998,80(3)：531.

[7] Hauer AD, Uyttenhove C, Vos PD, et al. Blockade of Interleukin-12 Function by Protein Vaccination Attenuates Atherosclerosis[J].Circulation, 2005,112(7)：1054-62.