乳酸菌發酵低糖桑葚復合果醬工藝優化及其風味成分分析

申光輝， 馮 孟， 張志清， 陳安均， 黎杉珊， 吳賀君

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

桑葚又名桑果、桑實、桑棗，富含白藜蘆醇、花青素、黃酮等多種生物活性成分[1-4]，具有抗氧化[5-6]和解酒[7]等功能。中國桑葚資源豐富，但因其成熟期集中，皮薄，含水量較高，貯藏難度大，資源加工利用率低，導致其深加工產品多元化程度不高。

利用益生乳酸菌發酵果蔬產生的香氣物質來改善果蔬產品的風味，并產生新的功能活性成分，提高其營養保健價值[8-11]，已成為國內外果蔬深加工研究的熱點之一。如利用乳酸菌發酵制得胡蘿卜汁[12]、番茄汁[13]、石榴汁[14]、南瓜汁[15]和櫻桃果泥[16]等功能性發酵果蔬汁(漿)產品。利用植物乳桿菌R23進行發酵，使枇杷果汁增加了以醇類和酸類為主的6種揮發性特征風味物質[17]。利用嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發酵，分別增加了西瓜汁中酸類揮發性風味物質和酮類揮發性風味物質[18]。接種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵龍眼果漿，可增加果漿醇類、醛類、酯類、酮類和酸類等18種揮發性風味物質[19]。

果醬是各種不耐貯藏漿果的主要加工產品[20]。目前，中國桑葚主要采用傳統果醬加工方式，其含糖量高(≥60%)[21]，產品種類單一，風味寡淡，無法滿足市場需求。因此，低糖桑葚果醬加工新工藝研究對其產業的可持續發展具有重要意義。多數研究主要通過添加胡蘿卜、番茄[22]或紅棗[21]等果蔬原料，提高低糖桑葚果醬的口感風味和營養價值。近年來，乳酸菌發酵工藝逐漸被應用于臍橙[23]、藍靛果[24]及桑葚[25]等果醬的加工中，以改善產品風味。但關于乳酸菌發酵對桑葚果醬風味物質成分影響的報道較少。本研究擬以桑葚為原材料，以富含VC、礦物質等多種營養元素的番茄和胡蘿卜為輔料，通過乳酸菌發酵改善低糖桑葚復合果醬的產品風味，采用離子色譜法測定發酵果醬有機酸組成及含量，頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯質譜法(SPME-GC-MS)分析乳酸菌發酵對桑葚果醬揮發性物質的影響，以期為桑葚果醬制備工藝的優化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 桑椹品種為無核大十果桑，采自四川德昌縣，番茄和胡蘿卜均購自本地農貿市場，蔗糖購自本地超市，脫脂乳粉購自伊利乳業有限責任公司，檸檬酸、海藻酸鈉、黃原膠、低甲氧基果膠(LMP)和氯化鈣(食品級)均購自河南千志商貿有限公司，伊仕特酸奶發酵劑(主要菌種為嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌)購自湖北安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 培養基與試劑 MRS液體培養基：蛋白胨10.00 g，牛肉膏10.00 g，酵母膏5.00 g，磷酸氫二鉀2.00 g，檸檬酸二銨2.00 g，乙酸鈉5.00 g，葡萄糖20.00 g，吐溫-80 1 ml，MgSO4·7H2O 0.50 g，MnSO40.25 g，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。乳酸、乙酸、甲酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、檸檬酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 采用儀器設備主要有：100 型膠體磨(鄭州玉祥公司產品)、WZS-1型阿貝折光儀(上海光學儀器廠產品)、pHS-320型酸度計(成都世紀方舟公司產品)、ZWY-2102C型恒溫搖床(上海智城分析儀器公司產品)、TA-Xplus型質構儀(超技儀器公司產品)、ICS-1100型離子色譜儀(Thermo公司產品)、7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent公司產品)、50/30 μm DVB/CAR/PDMS型頂空固相微萃取頭(Supelco公司產品)。

1.2 方法

1.2.1 果漿制備 挑選無機械損傷、無腐爛、無病蟲害的新鮮桑葚、番茄和胡蘿卜，用水漂洗干凈，分別蒸汽漂燙軟化。桑葚漂燙3 min后打漿，番茄十字形切4塊漂燙4 min后打漿，胡蘿卜切0.5 cm厚片漂燙8 min，按0.5 ml/g加水打漿。傳統果醬大都以單一原料果肉進行加工，為了使得果醬口感更豐富并提高果醬營養價值，對果醬進行多種原料復配。根據混料試驗結果，將各原料果漿按質量比為桑葚∶番茄∶胡蘿卜=7.3∶1.0∶1.7混勻，100 ℃沸水浴殺菌20 min，冷卻備用。

1.2.2 發酵種子液制備 菌種活化：將滅菌MRS培養液冷卻至室溫，接種乳酸菌菌劑，37 ℃、140 r/min恒溫振蕩培養，連續傳3代，直到活菌數大于等于 1×108CFU/ml。

種子液制備：分別配制復合果漿添加量為25%、50%、75%、100%的MRS培養基，按復合果漿添加量由低到高進行傳代培養，每代均在37 ℃、140 r/min條件下恒溫振蕩培養36 h，使發酵菌種逐步適應復合果漿的培養條件，每代測得活菌數均達到 1×108CFU/ml以上，即得發酵種子液。

1.2.3 乳酸菌發酵條件優化 根據預試驗結果，采用L9(34)正交試驗，以感官評價為指標，對接種量、發酵時間、蔗糖添加量、脫脂乳粉添加量4個主要影響因素進行優化，試驗因素及水平見表1。將制備好的發酵種子液接種于殺菌復合果漿中，37 ℃靜置發酵。按表2的評分標準對發酵果漿進行感官評價。

表1復合果漿乳酸菌發酵L9(34)正交試驗因素水平表

Table1FactorsandlevelsofL9(34)orthogonalexperimentoffruitpulpfermentedbylacticacidbacteria

水平接種量(CFU/ml)發酵時間(h)蔗糖添加量(%)脫脂乳粉添加量(%)11×104128321×1051610531×10620127

表2發酵果漿感官評分標準

Table2Sensoryevaluationcriteriaoffermentedfruitpulp

評分項目 評分標準分值口感(35分)口感純正,桑葚味濃,無異味26～35口感較純正,桑葚味較淡,少有異味16～25風味不正,無桑葚味,有異味0～15氣味(40分)具有桑葚特有香氣和良好酵香味,香氣濃郁31～40具有桑葚獨特香氣和較為良好的酵香味,香氣較淡16～30不具有桑葚香氣,有異味,較差的酵香味0～15色澤(25分)色澤呈深紫色或紫色,顏色均勻一致21～25色澤呈淡紫色,顏色基本均勻一致16～20不表現紫色,顏色不均勻0～15

1.2.4 果醬調配濃縮工藝優化 依據預試驗結果，采用U6(6×32×2)均勻試驗設計，以果醬感官品質、凝膠強度和黏度為指標，對蔗糖添加量、果漿pH值、復合增稠劑添加量和CaCl2添加量4個主要因素進行優化，試驗因素水平見表3。將發酵復合果漿調整pH后倒入不銹鋼鍋中進行預濃縮，分批添加糖漿，至可溶性固形物含量為40%左右時加入復合增稠劑(根據感官評價和質構獲得的最佳增稠劑配比為：低甲氧基果膠∶黃原膠=1∶1)和凝固劑CaCl2，攪拌均勻獲得發酵低糖桑葚復合果醬。根據果醬感官要求[26]，并結合乳酸菌發酵果醬風味特點制定果醬感官評價標準(表4)。由10名專業人員組成感官評價小組進行感官評價。凝膠強度、黏度采用質構儀測定，選用A/BE探頭，d40盤狀活塞，下降速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，上升速度1 mm/s，觸發力Auto-5 g，測試距離20 mm，記錄速度200 pps。

表3果醬調配濃縮U6(6×32×2)均勻試驗因素水平表

Table3FactorsandlevelsofU6(6×32×2)uniformexperimentintheprocessofjamconcentration

水平蔗糖添加量(%)果漿pH值復合增稠劑添加量(%)CaCl2添加量(%)15.003.200.500.02210.003.700.600.04315.004.200.70420.00525.00630.00

表4發酵低糖桑葚復合果醬的感官評定標準

Table4Sensoryevaluationcriteriaoffermentedlow-sugarcomplexmulberryjam

評分項目 評分標準分值氣味(15分)具有桑葚果香和良好的酵香味,香氣濃郁14～15具有桑葚果香和較為良好的酵香味,香氣稍淡11～13無桑葚果香,有異味0～10色澤(15分)色澤自然明亮,光澤度好,呈紫色或紫紅色14～15色澤較明亮,光澤度較差,淡紫紅色11～13色澤灰暗,光澤度差,非紫紅色0～10口感(30分)酸甜適中,果味濃郁26～30略偏酸或偏甜,果味較淡16～25酸甜比例不協調有異味0～15質構(30分)凝膠良好,無流散,無分層析水26～30基本形成凝膠,流散輕微,分層析水較少16～25未形成凝膠,流散緩慢,分層析水較多0～15涂抹性(10分)易涂抹,涂層均勻光滑9～10較易涂抹,涂層均勻但不光滑6～8難涂抹,涂層不均勻,不連貫0～5

1.2.5 果醬有機酸測定 采用離子色譜儀測定。色譜條件：IonPac AS18 (4 mm×250 mm)陰離子交換分析柱，AG18保護柱(4 mm×50 mm)。KOH淋洗液梯度洗脫條件：0～13 min 2 mmol/L，13～30 min 2～45 mmol/L，30～45 min 45 mmol/L，45～50 min 45～2 mmol/L；淋洗液流速1 ml/min；進樣體積25 μl，色譜池溫度35 ℃，柱溫30 ℃，抑制電流112.5 mA。樣品用純水稀釋100倍，過SPE-RP柱和SPE-Ag柱，去掉3 ml初濾液后經0.22 μm濾膜過濾，進樣分析，峰面積按外標法進行定量。

1.2.6 果醬揮發性風味物質分析 為考察乳酸菌發酵對桑葚復合果醬揮發性成分的影響，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯質譜法測定發酵低糖復合果醬的揮發性物質[27]，以未發酵低糖桑葚果醬為對照進行分析。頂空固相微萃?。喝? g果醬于15 ml采樣瓶中，加入NaCl調整其質量濃度為0.1 g/ml，超聲10 min，插入裝有萃取纖維頭的手動進樣器，60 ℃萃取30 min，快速移出萃取頭并插入氣相色譜進樣口，250 ℃熱解析3 min進樣。色譜條件：HP-5MS (30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱，進樣口溫度250 ℃，He載氣流量1 ml/min，不分流。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min升溫至190 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。質譜條件：電子轟擊電離(EI)源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質量掃描的質荷比范圍為33～550，接口溫度為250 ℃。利用GC-MS工作站的NIST 11.L標準圖庫對采集到的質譜圖進行檢索，根據匹配度來確定未知化合物，當相似度(SI)>80%時定性為對應化合物，采用峰面積歸一化法計算各成分相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵工藝條件優化

單因素試驗結果表明，乳酸菌接種量、發酵時間、蔗糖添加量和脫脂乳粉添加量4個發酵參數對乳酸菌發酵桑葚復合果漿的感官品質影響較大。表5和表6顯示，各影響因素的主次順序為：接種量>脫脂乳粉添加量>發酵時間>蔗糖添加量。接種量對發酵果漿感官分值具有顯著影響，而發酵時間、蔗糖添加量和脫脂乳粉添加量對發酵果漿感官分值的影響不顯著(表6)。采用L9(34)正交試驗確定最佳發酵條件，接種量1×105CFU/ml、發酵時間20 h、蔗糖添加量8%、脫脂乳粉添加量5%，在此條件下進行驗證發酵試驗，所得發酵果漿感官評分為83.6，與試驗組評分差異不大。

表5乳酸菌發酵果漿L9(34)正交試驗設計及結果

Table5Orthogonalexperimentdesignandresultsoffruitpulpfermentedbylacticacidbacteria

試驗號接種量發酵時間蔗糖添加量脫脂乳粉添加量感官分值Ⅰ111174.6±1.0Ⅱ122277.5±0.6Ⅲ133378.9±1.4Ⅳ212379.0±3.1Ⅴ223182.1±0.7Ⅵ231285.1±0.1Ⅶ313379.2±1.4Ⅷ321273.2±0.8Ⅸ332177.4±2.5k177.077.677.678.0k282.177.677.980.6k376.680.580.177.0Rj5.52.92.53.6

k1、k2、k3分別為各因素1水平、2水平、3水平的感官分值的平均值。Rj為極差。1、2、3見表1。

表6乳酸菌發酵果漿正交試驗方差分析結果

Table6Analysisofvarianceoforthogonalexperimentoffruitpulpfermentedbylacticacidbacteria

變異來源 平方和自由度均方F值P值接種量111.8233255.91177.58070.0118發酵時間33.0700216.53502.24190.1622蔗糖添加量21.0033210.50171.42380.2902脫脂乳粉添加量40.7233220.36172.76070.1162誤差66.380097.3756

2.2 果醬調配濃縮工藝優化

發酵低糖桑葚復合果醬制作的關鍵工藝在于蔗糖用量、初始pH、復合增稠劑添加量和CaCl2添加量。蔗糖的加入會在濃縮過程中加速果醬凝結，同時增加滲透壓，可起到一定的防腐作用，但蔗糖添加過多則會掩蓋原料果汁風味，導致果醬酸甜比例不適，風味較淡，蔗糖添加過少，則果醬凝結緩慢，達不到果醬在甜度上的需求。低糖果醬中蔗糖的添加量低(質量分數<50%)，影響果醬的凝膠效果，通過添加適量的增稠劑和凝固劑，在一定pH條件下才可以形成凝膠狀態良好、口感細膩的果醬。因此，采用U6(6×32×2)均勻設計確定最佳調配濃縮條件(表7)。

表7U6(6×32×2)均勻試驗設計及結果

Table7Experimentaldesignandresultsoftheuniformexperiment

試驗號X1X2X3X4Y1Y2(g)Y3(g·s)Ⅰ112277.5212.5-196.5Ⅱ223281.6225.8-216.5Ⅲ331277.8240.3-195.2Ⅳ413181.3283.2-210.3Ⅴ521183.8293.8-218.3Ⅵ632176.3276.3-204.6

X1：蔗糖添加量；X2：果漿初始pH值；X3：復合增稠劑添加量；X4：CaCl2添加量；Y1：感官評分；Y2：凝膠強度；Y3：黏聚性。1、2、3見表3。

分別以感官評分(Y1)、凝膠強度(Y2)及黏聚性(Y3)為優化指標，采用DPS 7.05軟件進行二次多項式逐步回歸分析，建立的回歸方程及檢驗結果分別為：

0.142 9X1X3+27.457 0X1X4

(1)

X1為蔗糖添加量，X2為果漿初始pH值，X3為復合增稠劑添加量，X4為CaCl2添加量。方程相關系數r=0.999 6，F=298.280 0，顯著水平P=0.043 4，剩余標準差S=0.189 7，調整相關系數ra=0.997 9，Durbin-Watson統計量d=2.70。

(2)

方程相關系數r=0.999 9，F=1 533.100 0，顯著水平P=0.019 2，剩余標準差S=0.958 0，調整相關系數ra=0.999 6，Durbin-Watson統計量d=2.66。

(3)

方程相關系數r=0.999 9，F=2 963.140 0，顯著水平P=0.013 8，剩余標準差S=0.202 1，調整相關系數ra=0.999 8，Durbin-Watson統計量d=1.83。

上述結果表明，所得3個回歸方程的P值均小于0.05，Durbin-Watson統計量d均為2.00左右，擬合結果較好。由各變量顯著性檢驗P值大小(表8)可知，各因素對樣品感官評分、凝膠強度及黏聚性的影響均存在交互作用(P<0.05)。

表8二次多項式逐步回歸結果

Table8Theresultsofquadraticpolynomialstepwiseregression

因變量影響因子偏相關系數t值P值感官評分X20.999123.86400.0018X2X2-0.999326.23150.0015X1X3-0.98445.59020.0305X1X40.997714.85690.0045凝膠強度X3-0.99388.93040.0123X2X20.998317.10420.0034X4X4-0.999848.59790.0004X2X40.998820.12110.0025黏聚性X30.999973.75210.0002X3X3-0.999854.42860.0003X4X40.999986.21080.0001X3X4-0.999972.49870.0002

X1、X2、X3、X4見表7注。

根據回歸方程(1)、(2)、(3)進行尋優計算，獲得感官評分、凝膠強度和黏聚性的最優參數。表9顯示，以不同指標所建立的回歸方程得到的尋優結果不完全相同，為驗證3個方程可靠性，分別對3組最優參數組合進行驗證試驗(表10)。3個不同回歸方程所得最優參數條件下制備的樣品感官評分、凝膠強度、黏聚性指標實測值與方程預測值相對誤差較小，表明3個方程的預測能力較好。同時，以感官評分優化獲得的最佳參數所制備的樣品，其凝膠強度和黏聚性均接近于其他2組優化條件下制備的產品，表明采用感官評價凝膠強度和黏聚性與質構儀器測定結果差異不大。但以凝膠強度、黏聚性為優化指標所得最優條件制備的果醬的感官評分略低，這可能是因為酸甜度對果醬口感的影響較大，而質構儀無法評價樣品的酸甜度。因此，綜合感官評價、凝膠強度和黏聚性所得的優化條件，最終確定調配濃縮的最優組合為：蔗糖添加量28.90%，初始pH值3.8，增稠劑添加量0.50%，氯化鈣添加量0.04%。該條件下制備的發酵低糖桑葚復合果醬呈明亮的紫紅色，具有桑葚清爽的果香，香氣協調，酸甜適中，醬體均勻細膩，凝膠良好，易涂抹，涂層均勻光滑，流散適宜，無分層析水現象，口感風味俱佳。

表9二次多項式逐步回歸濃縮條件尋優結果

Table9Theconcentrationconditionsobtainedbyquadraticpolynomialstepwiseregressionmodel

X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3見表7注。

表103組最優參數組合驗證試驗結果

Table10Theactualvaluesofjampreparedwiththreedifferentconcentrationconditions

最優參數組合X1X2X3X4實測值Y1Y2Y328.903.800.510.0494.70284.00-197.6027.703.500.500.0285.60289.00-203.5029.204.200.530.0483.20279.00-190.00

X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3見表7注。

2.3 有機酸分析

8種有機酸混標色譜圖如圖1顯示，有機酸是果醬重要風味和特征成分。表11顯示，從果醬樣品中共檢出7種主要有機酸，與未發酵果醬相比，乳酸菌發酵果醬中乳酸含量、乙酸含量和檸檬酸含量增加，琥珀酸含量、草酸含量和蘋果酸含量降低。因此，通過乳酸菌發酵增加了果醬中乳酸、乙酸及檸檬酸含量，特別是乳酸和檸檬酸含量的增加，改善了果醬感官品質，賦予發酵果醬厚重的口感。

1：乳酸；2：乙酸；3：甲酸；4：琥珀酸；5：蘋果酸；6：酒石酸；7：草酸；8：檸檬酸。圖1 8種有機酸標樣離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of eight organic acids

2.4 揮發性風味物質分析

表12顯示，2種桑葚果醬樣品中總共鑒定出13種揮發性成分，其中酯類8種，烯類4種，脂肪酸1種。其中乳酸菌發酵果醬中檢出11種揮發性成分，占總峰面積的40.61%，酯類7種，占36.42%，烯類3種，占1.98%，脂肪酸類1種，占2.21%。未發酵果醬中檢出5種揮發性成分，占總峰面積的30.41%，酯類3種，占27.65%，烯類2種，占2.76%。

發酵低糖桑葚復合果醬風味物質主要來源于原料和乳酸菌發酵代謝產物，即濃縮過程中新產生的物質。通過對發酵果醬和未發酵果醬的揮發性物質進行分析對比，發現兩者有3種共有的揮發性物質，其中發酵果醬右旋萜二烯和反-9-十八烯酸甲酯的相對含量均低于未發酵果醬，可能是因為其在發酵過程中的相關發酵底物被乳酸菌代謝利用。發酵果醬與未發酵果醬相比，增加了8種揮發性物質，包括5種酯類，2種烯類和1種脂肪酸，這些化合物賦予了桑葚發酵果醬獨特的風味和香氣。酯類化合物是發酵果蔬中一種很重要的揮發性風味物質，具有特殊的香味，同時酯類物質的閾值一般較低，對整個體系風味的貢獻很大[19]。因此，酯類物質是乳酸菌發酵低糖桑葚復合果醬風味的重要成分。

3 結 論

本研究獲得了乳酸菌發酵低糖桑葚復合果醬的最佳工藝：乳酸菌接種量 1×105CFU/ml，蔗糖添加量8.00%，脫脂乳粉添加量5.00%，發酵20 h,調整pH為3.8，蔗糖添加量28.90%，增稠劑(低甲氧基果膠∶黃原膠=1∶1)添加量0.50%，CaCl2添加量0.04%，進行濃縮，獲得的發酵低糖桑葚復合果醬產品呈明亮的紫紅色，具有桑葚果香和乳酸發酵芳香氣味，組織細膩，酸甜適中，穩定性好，其總糖含量(<42.00%)遠低于傳統果醬(含糖量≥65.00%)，符合當前消費者對食品三低(低糖、低鹽、低脂肪)的要求。利用乳酸菌對復合果漿進行發酵，增加了低糖桑葚復合果醬中乳酸含量、乙酸含量、檸檬酸含量以及揮發性物質種類和含量，尤其是酯類香氣成分，改善了產品的風味。

表11發酵低糖桑葚復合果醬與未發酵果醬有機酸含量的比較

Table11Comparisonoforganicacidscontentinfermentedlow-sugarcomplexmulberryjamandunfermentedjam

樣品 有機酸含量(mg/g)乳酸乙酸甲酸琥珀酸蘋果酸酒石酸草酸檸檬酸發酵果醬1.937±0.0050.162±0.0110.023±0.0030.984±0.0110.282±0.005-0.065±0.00616.400±0.256未發酵果醬0.083±0.0020.014±0.0010.029±0.0023.165±0.0180.704±0.008-0.088±0.00314.709±0.312

-：未檢測出化合物。

表12乳酸菌發酵對桑葚果醬揮發性成分的影響

Table12Effectoflacticacidbacteriafermentationonvolatilecomponentsofmulberryjam

編號保留時間(min)CAS號化合物名稱相對含量(%)發酵果醬未發酵果醬112.513387-41-5檜烯0.27-212.5228634-89-1β-側柏烯-0.43314.445989-27-5右旋萜二烯1.582.33415.4799-85-4萜品烯0.13-537.555129-60-214-甲基十五酸甲酯6.13-637.56112-39-0棕櫚酸甲酯-5.62739.521731-92-6十七酸甲酯0.20-840.60112-63-0亞油酸甲酯8.66-940.691937-62-8反-9-十八烯酸甲酯13.9419.291041.05112-61-8硬脂酸甲酯2.892.741141.4260-33-3亞油酸2.21-1241.871000336-44-09,11-十八碳二烯酸甲酯1.19-1343.431120-28-1花生酸甲酯3.41-

-：未檢測出化合物。

在果蔬汁發酵中，不同的乳酸菌菌種對果蔬汁的適應性及其對原料功能性成分的影響不同[15,18,28]。本研究僅采用市售乳酸菌發酵菌劑進行試驗，證實了乳酸菌發酵可通過產生乳酸等有機酸以及酯類等香氣成分改善桑葚低糖果醬的風味，但仍需進一步篩選適應性更強的發酵菌株，并分析發酵對桑葚功能性活性成分及其有效性的影響。

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