番鴨IGF-I基因克隆及其在肌肉組織發育中的表達規律

董 飚, 王 健, 段修軍, 孫國波

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300)

采用性狀獨立淘汰法、綜合指數法等傳統的育種方法使畜禽生產性能得到了較大幅度的提升，但是生產性能到達一定水平后很難繼續取得較大成效。隨著分子生物學技術的出現和快速發展，一些基因的功能得到了驗證，基于功能基因的現代育種手段可以快速、有效地提升畜禽生產性能。畜禽動物的生長受到神經內分泌生長軸的調控，其中起主導作用的是下丘腦-垂體-靶器官途徑，此生長軸涉及胰島素樣生長因子、肌肉生長抑制因子、生長激素及其受體等一些功能基因。

胰島素樣生長因子(insulin like growth factors，IGF)最先在大鼠體內發現，其介導生長激素的促生長作用，與胰島素許多結構高度相似，能與胰島素受體競爭性結合，有類似胰島素的作用，因此獲得其名稱。胰島素樣生長因子-I(IGF-I)是胰島素樣生長因子家族成員之一，是細胞生長增殖的調控信號之一，對機體細胞增殖、分化具有重要調控作用，在畜禽生長過程中發揮調控瘦肉率的作用。IGF-I基因在組織中的表達量和其功能有著密切的關系，對其進行研究具有重要的意義。在對大圍山微型雞、武定雞和艾維茵肉雞的研究中發現，雞肝臟中IGF-I基因的表達量與體質量、體尺呈顯著正相關[1]。在孵化13 d的鴨胚肝臟組織中就可以檢測到IGF-I基因的mRNA表達，在早期生長發育過程中肝臟組織中IGF-I基因mRNA表達量與體質量的變化趨勢一致，呈現極顯著正相關[2]。同樣，IGF-I在鴨肝臟組織中表達量有特定的發育模式且在品種之間存在差異[3]。在孵化7～17 d的雞、鵪鶉及雜交后代胚胎肌肉中就可以檢測到IGF-I基因mRNA表達，在孵化10 d時達到第一次峰值，孵化 15～16 d時達到第二次峰值，而且IGF-I基因mRNA表達規律與成肌細胞增殖和肌管融合規律一致[4]。雞胚胎孵化中期(孵化9 d和孵化13 d)腿部肌肉組織IGF-I基因mRNA表達量顯著高于孵化后期(孵化20 d)，這可能與胚胎腿部肌肉的發育速度有關，中期發育速度較快，后期發育速度相對遲緩[5]。高郵鴨和金定鴨胚胎胸肌和腿肌成肌細胞中IGF-I基因mRNA表達規律基本一致[6]。在家禽胚胎期和早期生長發育過程中，IGF-I基因在組織中的表達研究已經取得一定的成績。

在家禽生長發育過程中，IGF-I基因在肌肉組織中又是如何表達的。鑒于此，本研究根據GenBank上公布的禽類IGF-I基因序列設計引物，通過克隆、測序獲得番鴨IGF-I基因序列，并采用生物學軟件進行分析。同時采集番鴨早期第2、4、6、8、10、13周齡的肌肉組織，采用實時熒光定量PCR方法檢測IGF-I基因在番鴨肌肉生長過程中的mRNA表達規律，為開展IGF-I基因功能研究增加資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在番鴨2、4、6、8、10、13周齡時，各個時期末隨機抽取10只鴨，公母各半。屠宰放血后，采集胸肌、腿肌組織置于液氮速凍，-80 ℃凍存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計 根據GenBank中公布的禽類IGF-I基因序列，用DNAMAN軟件尋找該基因保守區并設計引物，引物由上海桑尼生物技術有限公司進行合成。引物序列及信息見表1，其中引物A1是用于IGF-I基因克隆，A2、A3分別用于實時熒光定量PCR時用于擴增IGF-I、β-actin基因。

表1基因克隆和mRNA表達所用引物信息表

Table1ThebasicinformationofprimersusedingenecloningandmRANexpression

引物名稱 引物序列(5'→3')擴增產物(bp)退火溫度(℃)A1F:TGCCCTCAACATCTCA-CATC56355R:TGGCACATTCATTCT-TCATTCTA2F:TGCTTCCAGAGTTGTGAC-CT15660R:TCCTGTGTTCCCTCTACT-TGA3F:CTATGTCGCCCTG-GATTTCG14760R:AAAGATGGCTG-GAAGAGGGC

1.2.2 RNA提取及反轉錄 采用Trizol試劑提取肌肉組織中總RNA，用核酸濃度測定儀檢測RNA濃度和純度，并用瓊脂糖凝膠快速電泳檢測RNA的質量。檢測完成按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書進行操作，以適量RNA為模板、Oligo(DT)為引物在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。

1.3 PCR擴增

以cDNA為模板，引物A1進行PCR擴增獲得IGF-I片段。PCR反應體系為25 μl：10×PCR 緩沖液 (無Mg2+) 2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/L)2.0 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，上、下游引物 (10 μmol/L)各 1.0 μl，Taq聚合酶 (5 U/μl) 0.2 μl，cDNA模板 1.0 μl，dH2O 16.8 μl。

1.4 克隆測序

將純化后的PCR產物與pMD19-T載體連接，然后轉化到感受態細胞DH5-α中，在含有氨芐青霉素的LB培養基平板上劃線，37 ℃培養12 h。隨機挑取菌落，用菌液PCR法和酶切質粒法篩選陽性克隆，每對引物挑選2個陽性克隆送上海桑尼生物技術有限公司測序。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

反應體系為：UltraSYBR Mixture (2×) 10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，模板 2.0 μl，加入滅菌蒸餾水至20.0 μl。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。

1.6 統計分析

基因測序結果用NCBI上的BLAST進行序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.BLAST/)，序列的翻譯和不同物種之間序列進化關系作圖用DNAMAN 6.0軟件進行分析。不同組別之間基因表達差異性采用SPSS17.0統計分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 IGF-I基因PCR擴增結果

取任意1個番鴨胸肌組織提取總RNA，然后進行反轉錄合成cDNA，以引物A1進行PCR擴增，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示，PCR擴增產物處于 500～750 bp，與預期的結果較為相似，初步斷定其可能是IGF-I基因的序列。

1：分子量標準，DL2000；2、3：引物A1的PCR擴增產物。圖1 番鴨IGF-I基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of IGF-I gene PCR products about Muscovy duck

2.2 序列分析結果

通過克隆測序獲得563 bp的cDNA序列(圖2)。運用軟件分析發現這段序列包括了91 bp的5′端、462 bp的編碼區、10 bp的3′端，編碼153個氨基酸。

圖2 番鴨IGF-I基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequence of IGF-I gene on Muscovy duck

2.3 物種間序列同源性比較

不同物種之間IGF-I基因編碼區核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列同源性見表2、表3。由表2可知，番鴨與野鴨(EU031044)、鵝(DQ662932)、雞(FJ977570)、人(NM_000618)、小鼠(NM_001111275)、牛(HQ324241)、豬(JX827417)等物種IGF-I基因核苷酸序列同源性達 76.8%～99.1%，其中與鵝同源性最高，與小鼠的同源性最低。由表3可知，番鴨與野鴨、鵝、雞的氨基酸序列同源性較高，均在98.7%以上，與小鼠、牛、豬的同源性為 77.8%～83.7%。

表2不同物種IGF-I基因核苷酸序列的相似性

Table2SimilaritycomparisonofnucleotidesequenceofIGF-Igeneindifferentanimals

動物相似度(%)番鴨野鴨鵝雞人小鼠牛野鴨98.9鵝99.199.4雞98.198.398.1人80.580.781.080.7小鼠76.876.876.877.388.7牛79.479.979.980.193.586.8豬80.380.780.780.793.588.394.4

表3不同物種IGF-I基因編碼的氨基酸序列的相似性

Table3SimilaritycomparisonofaminoacidsequenceofIGF-Igeneindifferentanimals

動物相似度(%)番鴨野鴨鵝雞人小鼠牛野鴨98.7鵝99.399.3雞98.798.799.3人83.783.083.784.3小鼠77.877.177.877.891.5牛83.082.483.083.796.190.2豬83.783.083.784.396.190.298.0

根據IGF-I基因編碼的氨基酸序列同源性構建關系樹(圖3)，主要分為兩大類，一類是番鴨、野鴨、鵝和雞禽類聚在一起，另外一類是哺乳動物聚在一起，其中豬和牛先聚在一起，然后再與人、小鼠聚在一起。

圖3 不同物種IGF-I基因編碼的氨基酸序列同源關系樹Fig.3 Homologous relationship tree of IGF-I gene amino acid sequence in different animals

2.4 肌肉組織IGF-I基因mRNA表達

本試驗采用qRT-PCR方法檢測了番鴨生長過程中IGF-I基因在胸、腿肌組織中mRNA表達規律，詳細見表4。在公鴨胸肌組織中，第2周齡IGF-I基因mRNA表達量顯著性高于其他周齡；第6、8、10周齡間基因mRNA表達量無顯著性差異，均顯著性高于第4、13周齡；第4、13周齡間表達量無顯著差異。在母鴨胸肌組織中，同樣第2周齡表達量顯著性高于其他周齡；第6、8周齡間表達量無顯著差異，顯著性高于第4、10、13周齡；第4、10、13周齡間表達量無顯著差異。

在公鴨腿肌組織中，第2周齡IGF-I基因mRNA表達量最高，顯著性高于其他周齡；第8、10周齡間表達量無顯著性差異，顯著性高于第4、6、13周齡；第6、13周齡間表達量無顯著性差異，顯著性高于第4周齡。在母鴨腿肌組織中，第2周齡IGF-I基因mRNA表達量最大，顯著高于其他周齡；第13周齡表達量顯著高于第4、6周齡，第4、6、10周齡間表達量無顯著差異。

在肌肉組織中IGF-I基因mRNA的表達量均表現為第2周齡最高，然后下降，在第4周齡出現最低點，不同性別、組織中回升的速度不同，在最后階段，除母鴨腿肌外，其他肌肉組織中IGF-I基因mRNA表達量再次下降。

表4番鴨不同時期IGF-I基因表達量

Table4IGF-IgeneexpressionofMuscovyduckatdifferentstages

周齡公鴨胸肌腿肌母鴨胸肌腿肌20.74±0.11a0.46±0.04a1.14±0.14a0.28±0.09a40.24±0.04c0.13±0.02d0.16±0.03c0.02±0.01c60.52±0.02b0.21±0.02c0.74±0.03b0.05±0.01c80.61±0.04b0.33±0.03b0.71±0.05b0.07±0.02bc100.61±0.04b0.34±0.04b0.17±0.03c0.09±0.02bc130.21±0.03c0.24±0.04c0.21±0.02c0.14±0.02b

同一列數據后不同字母表示差異顯著(P<0.0.5)。

3 討 論

隨著人類基因組計劃的順利實施完成，生物技術的快速發展，測序效率的提升，成本的降低等，促進了其他動物基因組測序工作。動物基因組測序結果有利于開展相關基因后續研究工作。在禽類，雞的基因組序列早已公開，鴨和鵝基因組測序工作已經結束，但是序列未公開發布。本試驗對番鴨IGF-I基因進行克隆和序列分析，獲得了1個cDNA序列，其中編碼區序列包括了462 bp，編碼153個氨基酸，番鴨與野鴨、鵝、雞IGF-I基因核苷酸序列的同源性比較高，在98.1%以上，而與人和哺乳動物的同源性在80%左右，物種間的進化關系結果表明鴨IGF-I基因的功能與其他家禽更為相似。

IGF-I是一種高效能因子，通過影響動物蛋白沉積、肌細胞增殖、成肌細胞分化以及肌管融合等方式促進動物骨骼肌生長發育[7]。史旭升等[8]在28日齡、56日齡鵝的胸肌、腿肌組織中均可以檢測到IGF-I基因mRNA表達，且28日齡的肌肉中表達量要高于56日齡，這說明IGF-I基因可能參與調控鵝肌肉的生長發育。Serrano等[9]在第12-16 d的雞胚大腦、胰腺組織中可以檢測到IGF-I基因mRNA的表達，在肝臟中沒有檢測到，出殼后肝臟組織中IGF-I基因的mRNA表達量才逐漸升高，說明胚胎期間所有的IGF-I均來自肝外組織。Richards等[10]發現火雞孵化第14 d就可以在腦和肝臟組織中檢測到IGF-I基因mRNA表達，但是在整個孵化期間IGF-I基因mRNA表達量都比較低，在出殼后快速上升，第3周齡時組織中IGF-I基因表達量是胚胎期的8倍，腦組織中IGF-I基因mRNA表達量比肝臟組織中高，而且腦組織中的表達量隨著生長逐步上升，在3周齡時達到最高值。試驗結果顯示，肌肉組織中IGF-I基因mRNA表達量在第2周齡最高，這與Yun等在肉雞上的研究結果[11]較為相似。但是番鴨在第4～6周齡時表達量出現了反彈現象，這又與在雞上的表達存在差異，說明IGF-I基因在家禽早期生長發育過程所起的作用是相似的，但是會受到物種因素的影響而不同。公番鴨胸肌組織中IGF-I基因mRNA表達量在第8～10周齡出現下降，而母鴨在10～13周齡出現下降；公鴨腿肌組織中IGF-I基因mRNA表達量在第10周齡出現反彈高峰，而母鴨在13周齡還在反彈。IGF-I基因在公、母鴨肌肉組織中表達規律的差異可能與公、母番鴨的生長速度不同有關，在前期的工作中可發現剛出雛時公、母番鴨的體質量較為接近，但是公鴨的生長速度要比母鴨快，在第2周齡開始差異就已經達到了顯著性水平，在10周齡左右公鴨的體質量一般是母鴨的1.5倍[12]。胸肌組織中IGF-I基因mRNA表達量要比腿肌組織中高，這是否與胸肌組織發育比褪肌組織發育遲、發育時間長有關，還需進一步認證。通過本試驗，闡述了番鴨IGF-I基因在肌肉生長發育過程中的表達規律，為進一步研究IGF-I基因的功能以及通過日糧營養調控其表達提供了資料。

[1] 榮 華,豆騰飛,張麗春,等. 大圍山微型雞IGF-I基因表達量與生長性狀的相關性分析[J]. 中國家禽, 2015, 37(4):5-8.

[2] 胡 艷,宋 遲,宋衛濤,等. 鴨發育早期肝臟IGF-ImRNA的表達特異性及其與體質量的相關性分析[J]. 南京農業大學學報, 2013, 36(6):95-99.

[3] 常明雪,朱文奇,章玲玲,等. 不同日齡鴨肝臟中IGF-I及IGF-IR基因表達規律的研究[J]. 揚州大學學報(農業與生命科學版)，2013, 34(1):23-27.

[4] 梁耀偉,趙宗勝,陳丹盈,等.IGF-I在不同雞與鵪鶉雜交禽胚胎肌肉發育過程中的表達規律與差異[J]. 新疆農業科學, 2012,49(9)：1717-1722.

[5] 商 鵬,張 浩,張 博,等.IGF-I及其受體IGF-IR基因在雞胚胎腿肌發育過程中表達模式分析[J]. 中國農業大學學報, 2017,22(1):48-51.

[6] 姬改革,陶志云,朱春紅,等. 不同品種鴨胚胎期骨骼肌成肌細胞GHR核IGF-ImRNA表達差異分析[J].浙江農業學報, 2016,28(3)：406-411.

[7]FROST R A, LANG C H. Multifaceted role of insulin-like growth factors and mammalian target of rapamycin in skeletal muscle[J]. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America, 2012, 41(2):297-322.

[8] 史旭升,孫永峰,楊童奧,等. 胰島素樣生長因子I基因在鵝不同發育時期肌肉組織中的表達[J]. 吉林農業大學學報, 2011, 33(2):214-217.

[9] SERRANO J, SHULDINER A R, ROBERTS C T, et al．The insulin-like growth factor I (IGF-I) gene is expressed in chick embryos during early organogenesis[J]. Endocrinology, 1990, 127(3):1547-1549．

[10] RICHARDS M P, POCH S M, MCMURTRY J P. Expression of insulin-like growth factor system genes in liver and brain tissue during embryonic and post-hatch development of the turkey[J]. Comp Biochem Physiol Part A Mol Integr Physiol, 2005, 141(1)：76-86.

[11] YUN J S, SEO D S, KIM W K, et al. Expression and relationship of the insulin-like growth factor system with posthatch growth in the Korean Native Ogol chicken [J]. Poultry Sci, 2005, 84(1):83-90.

[12] 吉文林,段修軍,孫國波,等. 黑羽番鴨2個品系生長發育規律及體尺比較[J]. 江蘇農業科學，2012, 40(12):205-207.