狼毒粉、狼毒大棗湯的單次給藥毒性研究

2018-03-07 20:09:36馬立威樊麗倪世宇

中國醫藥導報 2018年2期

馬立威+樊麗+倪世宇

[摘要] 目的研究狼毒粉（EFSP）、狼毒大棗湯（DEFSJ）的單次給藥毒性反應，為安全用藥提供參考。方法分別制備EFSP、DEFSJ，采用改良寇式法測定其半數致死量（LD50）及其95%可信度；并通過檢測小鼠血液生化學和組織病理學檢查評價其對小鼠肝、腎功能的影響。結果 EFSP的LD50為2.12 g/kg，95%可信限為1.61～2.78 g/kg，DEFSJ的LD50為12.60 g/kg，95%可信限為9.65～16.48 g/kg。EFSP、DEFSJ給藥組與棗湯組比較，隨著給藥劑量的增加，體重呈顯著降低趨勢，但臟器系數變化不明顯；小鼠血液生化學結果顯示，血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平均升高（P < 0.05），肌酐、血尿素氮水平有升高的趨勢；病理學檢查結果顯示，兩藥對小鼠的肝、腎功能有一定的損傷。結論 EFSP、DEFSJ均有一定的肝、腎毒性。

[關鍵詞] 狼毒粉；狼毒大棗湯；改良寇式法；單次給藥毒性

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（b）-0004-06

[Abstract] Objective To study single drug toxicity of Euphorbia fischeriana Steud Powder （EFSP） and Decoction of Compatibility of Euphorbia fischeriana Steud and Jujubae （DEFSJ） and provide a reference for safe medication. Methods Modified Karber method was adopted to detect lethal dose 50 （LD50） and the 95% confidence interval of EFSP and DEFSJ. Blood biochemistry and histopathology were detected to evaluate the toxicity of EFSP and DEFSJ on liver and kidney of mice. Results The LD50 of EFSP was 2.12 g/kg， and the average 95% confidence interval was 1.61-2.78 g/kg. The LD50 of DEFSJ was 12.60 g/kg， and the average 95% confidence interval was 9.65-16.48 g/kg. Compared with the Jujubae Decoction group， as the dosage was increased， the mice weight was significantly decreased， however， organ coefficient was not obviously changed in EFSP and DEFSJ groups. The blood biochemical results showed that the levels of alanine transaminase and aspartate transaminase were elevated （P < 0.05）， and the levels of creatinine and blood urea nitrogen had an increased tendency. Pathological changes of kidney and liver were found by histopathological examination. Conclusion Both EFSP and DEFSJ have definite toxicity on kidney and liver.

[Key words] Euphorbia fischeriana Steud Powder； Decoction of Compatibility of Euphorbia fischeriana Steud and Jujubae； Modified Karber methods； Single dose toxicity

狼毒粉（EFSP）中的狼毒為大戟科植物狼毒大戟的干燥根；狼毒大戟是中藥狼毒的主流產品；狼毒大戟主要分布于東北、河北和河南等省區，資源豐富，藥源充足。狼毒大戟始載于《神農本草經》，因其具有散結、逐水、止痛、殺蟲等功能，臨床用于治療腫瘤、結核病和皮膚病等，在民間兼用作植物殺蟲劑，用于防治螟蟲、蚜蟲、地蛆等[1-2]。狼毒大棗湯（DEFSJ）為中藥狼毒大戟和大棗按一定比例混合，經浸泡、煎煮、濃縮后制成的湯劑；民間有偏方用狼毒蒸大棗，食其棗來治療實體瘤，但目前尚沒有這方面的文獻報道；有報道[3]，自制DEFSJ臨床應用治療關節炎、黃水、銀屑病、淋巴腺結核等；關于其毒性，也有文獻報道，患者服用其治療銀屑病出現中毒的現象[4]。本文以EFSP、DEFSJ為研究藥物，觀察其對小鼠的單次給藥毒性作用，為其進一步的臨床開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

大棗（陜西綠音狗頭棗）；狼毒大戟（道地藥材，采于黑龍江省泰康縣）；谷丙轉氨酶（ALT）試劑盒（羅氏，REF 20764957，LOT 621149-01）；谷草轉氨酶（AST）試劑盒（羅氏，REF 20764949，LOT 618503-01）；肌酐（Cr）試劑盒（羅氏，REF 03263991，LOT 617550-01）；尿素氮（BUN）試劑盒（羅氏，REF 04460715，LOT 120125-01）；SPF級鼠糧及墊料（北京科奧協力飼料有限公司）。endprint

1.2 實驗儀器

R-220型旋轉蒸發儀（瑞士，BUCHI公司）；NLD-6DJ型細胞破壁機（中國，濟南納力德超微粉碎技術有限公司）；cobasc311型全自動生化分析儀（瑞士，羅氏）；AL204型電子天平（德國，梅特勒-托利多公司）；BXF53型顯微鏡（日本，OLYMPUS）；VIP5型全自動組織脫水機（日本，櫻花醫療科技有限公司）；TEC5型組織包埋機（日本，櫻花醫療科技有限公司）。

1.3 實驗動物

昆明種小鼠，飼養室環境溫度控制在（22±3）℃，相對濕度60%，12 h光暗周期，小鼠飼養按照SPF動物飼養規范進行，4～5周齡，雌雄各半，體重18～22 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供，生產許可證：SCXK（黑）2013-001，飼養于齊齊哈爾醫學院實驗動物中心，飼養許可證：SYXK（黑）2016-001，適應性喂養3 d后進行實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗藥物的制備

1.4.1.1 棗湯的制備取大棗1 kg，加水10 L浸泡，煎煮，過濾后，旋轉蒸發儀濃縮，得濃縮液2 L。

1.4.1.2 EFSP的制備取狼毒大戟干燥根若干，粉碎后經細胞破壁機打成超微粉，稱取超微粉10 g，以棗湯為溶劑溶解，加100 mL棗湯，相當生藥量為0.1 g/mL，混合均勻后，備用。

1.4.1.3 DEFSJ的制備取新鮮狼毒若干，與大棗和蒸餾水按照質量比1∶1∶10的比例混合，取狼毒1 kg，大棗1 kg，加水10 L，浸泡30 min，煎煮2 h/次，共煎煮2次，過濾后，旋轉蒸發濃縮2 L后，備用（參照EFSP制備，棗湯相當溶劑，生藥量為0.5 g/mL）。

1.4.2 單次給藥毒性預實驗

取小鼠若干只，雌雄各半，禁食12 h，不禁水，按照藥理學實驗方法[5]，找到EFSP和DEFSJ對應的最小給藥劑量（Dmin）值及最大給藥劑量（Dmax）值。最后得到，EFSP的Dmin值為0.37 g/kg，Dmax值為6.00 g/kg；DEFSJ的Dmin值為1.88 g/kg，Dmax值為30.00 g/kg。

1.4.3 單次給藥毒性正式實驗分組及給藥

按預實驗結果，EFSP和DEFSJ的正式實驗均分7個劑量組（空白組、棗湯組和5個藥物組），每組12只，雌雄各半。空白組給予生理鹽水，EFSP各劑量組依次為0.37、0.75、1.50、3.00、6.00 g/kg；DEFSJ各劑量組依次為1.88、3.75、7.50、15.00、30.00 g/kg；給藥后連續觀察14 d，其間記錄各劑量組小鼠藥后的毒性反應及死亡情況，對死亡小鼠及時尸檢，并肉眼觀察臟器的變化情況；同時于給藥第4、9、14天測定各劑量組存活小鼠體重；實驗結束后，處死取各劑量組存活小鼠，眼球取血，分離血清，上全自動生化分析儀測定相關生化指標；并取其組織（心、肝、脾、肺、腎）稱重，臟器系數按照公式臟器質量（g）/體重（kg）計算；同時取各組小鼠的肝、腎組織，多聚甲醛固定后，HE染色，光鏡下觀察其組織病理學變化情況。

1.5 統計學方法

數據采用SPSS 16.0軟件統計，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EFSP的單次給藥毒性實驗結果

2.1.1 給藥后觀察

小鼠接受單劑量EFSP后約30 min出現不同程度的中毒及死亡中毒小鼠主要表現為躁動后安靜、而后出現抽搐、痙攣、呼吸急促等；給藥后25 min開始出現死亡，動物死亡時間大多集中在藥后6 h內，個別劑量組出現在2～3 d內。隨著劑量的遞減癥狀減輕，死亡率降低，各劑量組存活動物給藥后第4天開始逐漸恢復，存活動物連續觀察至藥后14 d，動物一般狀況較好，無明顯異常。空白組及棗湯組小鼠活動自由，大小便正常，無任何中毒表現；對死亡小鼠進行大體解剖肉眼觀察，個別小鼠肝臟呈現發黑，腎臟有腫脹的現象，其他臟器無明顯變化。

2.1.2 對體重的影響

給藥前各劑量組小鼠體重比較差異無統計學意義（P > 0.05）。給藥后，與空白組比較，棗湯組在第4、14 天時體重升高，在第9天時體重降低，但差異無統計學意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，EFSP 0.75 g/kg組在第4天時，及EFSP 1.50、3.00 g/kg組在第4、9、14天時體重均下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.1.3 對血液生化學的影響

與空白組比較，棗湯組AST、Cr值升高，差異有統計學意義（P < 0.05），ALT、BUN值升高，但差異無統計學意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，EFSP 0.37、0.75、1.50、3.00 g/kg組ALT、AST、Cr、值及EFSP 1.50、3.00 g/kg組BUN值均升高，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.1.4 對臟器系數的影響

與棗湯組比較，EFSP 3.00 g/kg組的心、脾系數值增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.1.5 組織病理學HE染色檢測結果

空白組與棗湯組，肝組織中肝竇數量多且清楚，肝小葉界限明顯；EFSP 0.37 g/kg組，肝組織未見明顯異常，EFSP 0.75、1.50、3.00 g/kg組小鼠肝臟均可見不同程度的肝小葉結構消失，界限模糊不清，肝細胞可見較多的顆粒變性，胞質疏松化，肝竇變窄，出現壞死灶。空白腎組織中腎小管排列整齊，腎小球清晰；EFSP 0.37、0.75 g/kg組腎組織未見明顯異常，EFSP 1.50、3.00 g/kg組小鼠腎臟切片均可見腎小管上皮細胞呈現不同程度的水腫，部分腎小球體積增大，細胞數目增多。見圖1。endprint

2.1.6 小鼠死亡情況及LD50、95%可信限

EFSP各劑量組的小鼠死亡分布見表4。

2.2 DEFSJ單次給藥毒性實驗結果

2.2.1 給藥后觀察

各劑量組給藥后情況同“2.1.1”。

2.2.2 對體重的影響

給藥前各劑量組小鼠體重比較差異無統計學意義（P > 0.05）。給藥后，與空白組比較，棗湯組在4、9、14 d時體重升高，但差異無統計學意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，DEFSJ 1.88 g/kg組在4 d時，DEFSJ 3.75 g/kg組在14 d時，DEFSJ 7.50 g/kg組在9、14 d時及DEFSJ 15.00 g/kg組在4、9、14 d時體重均下降，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表5。

2.2.3 對血液生化學影響

與空白組比較，棗湯組ALT、AST、Cr、BUN值升高，但差異無統計學意義（P > 0.05）；與棗湯組比較，DEFSJ 1.88、3.75、7.50、15.00 g/kg組ALT、AST、Cr值及DEFSJ 15.00 g/kg組BUN值均升高，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表6。

2.2.4 對臟器系數影響

與棗湯組比較，DEFSJ 7.50、15.00 g/kg組的心、脾系數及DEFSJ 15.00 g/kg組的肺系數值增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表7。

2.2.5 組織病理學HE染色檢測結果

空白組與棗湯組的肝、腎組織病理學結果正常，DEFSJ 1.88、3.75 g/kg組肝組織未見明顯異常，DEFSJ 1.88、3.75、7.50 g/kg組腎組織未見明顯異常，DEFSJ 7.50、15.00 g/kg組肝組織及DEFSJ 15.00 g/kg組腎組織理學檢測變化情況同“2.15”，結果同圖1。

2.2.6 小鼠死亡情況及LD50、95%可信限

各劑量組的小鼠死亡分布見表8。

3 討論

隨著中草藥的廣泛應用，由于配伍不當或某些藥物劑量過大等原因，中藥的毒副作用也越來越引起大家的關注[6-8]。狼毒大戟性苦寒，有毒，為峻下逐水藥，亦有保護肝細胞和促進肝功能恢復等多種藥理功效[9-11]。臨床上常配伍大棗使用治療肝癌、乳腺癌等腫瘤性疾病，大棗甘緩和中，益氣和胃，能減少脾胃對毒性藥物的反應，使攻下而不傷正，能緩和狼毒大戟峻猛的藥性，減其毒性[12-13]。也有文獻報道，大棗味甘、性濕，功能補脾和胃，益氣生津，滋心潤肺，養血安神，悅顏色，通九竅，助十二經，和百藥，久服輕身延年，與狼毒合用，強療效，預防復發并緩解狼毒的毒性及對胃腸的刺激作用[14]；但其是否確能降低大戟科植物的毒性目前未能得到證實[15]。

目前，對狼毒大戟藥材的研究多集中在化學成分的提取和分離，主要有二萜、三萜、鞣質、甾醇、蒽醌類等[16-19]。本研究所用藥液為狼毒大戟原藥磨成細粉與棗湯混合和狼毒大戟與大棗的水煎劑兩種形式，來探討狼毒大戟與大棗配伍使用的毒性大小；最終得到，EFSP的LD50為2.12 g/kg，95%可信限為1.61～2.78 g/kg；DEFSJ的LD50為12.60 g/kg，95%可信限為9.65～16.48 g/kg；狼毒大戟中萜類成分較多，二萜類化合物為主要活性成分[18]；萜類化合物主要存在于石油醚、乙酸乙酯等有機相提取物中，本研究中所用的DEFSJ為水煎劑，EFSP中的狼毒為原植物粉，故對比而言DEFSJ的毒性比EFSP小；而對于傳統中藥而言水煎劑使用更廣泛，更具有實用意義，故本研究藥液采用水煎劑形式。本研究中隨著給藥劑量的增加，小鼠體重變化較明顯，由于體重變化的顯著而多數臟器在給藥后較短的時間內重量變化不太明顯，導致小鼠的臟器系數出現無規律的變化；但病理學及生化學結果均證實兩藥有一定的肝、腎毒性。

綜上所述，EFSP和DEFSJ兩藥均有一定毒性；本研究只起到為臨床狼毒大戟的安全用藥提供參考的作用，具體狼毒大戟與大棗配伍后是否真正達到減毒、強療效的作用還有待進一步研究。

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