葛根素在腦缺血再灌注損傷時對局部腎素—血管緊張素系統的影響

王澤+張永濤+李珊

[摘要] 目的 探討葛根素在腦缺血再灌注損傷（IRI）時對腦組織局部腎素-血管緊張素系統（RAS）的影響。 方法 選擇Wistar大鼠60只，并按隨機數字表法將其分為對照組（假手術）、模型組（線栓法成功制造大鼠腦IRI）和治療組（線栓法成功制造大鼠腦IRI的同時給予葛根素進行干預）；術后24 h處死實驗動物，并采用Zea-Longa神經行為學評分評價大鼠的神經功能，HE染色觀察大鼠腦組織的變性細胞指數（DCI），放射免疫法、Real-time PCR、Western blot檢測大鼠腦組織RAS主要組分[血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素轉化酶（ACE）、血管緊張素Ⅱ 1型和2型受體（AT1R和AT2R）]的表達。 結果 模型組和治療組大鼠的神經行為學評分、DCI、AngⅡ、ACE、AT1R和AT2R均明顯高于對照組（P < 0.05），當給予葛根素干預后，治療組大鼠的神經行為學評分和DCI均較模型組下降（P < 0.05），同時伴隨著腦組織局部RAS主要組分的下降（P < 0.05）。 結論 葛根素對大鼠腦IRI的保護作用可能與其抑制了腦組織局部RAS有關。

[關鍵詞] 腦缺血再灌注損傷；葛根素；腎素-血管緊張素系統

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（b）-0009-05

[Abstract] Objective To explore the effect of puerarin on the local cerebrum renin-angiotensin system （RAS） in cerebral ischemia reperfusion injury （IRI）. Methods A total of 60 Wistar rats were selected and divided into the control group （sham operation）， the model group （rats in the model group were established as cerebral IRI model by inserting a monofilament into middle cerebral artery） and the treatment group （rats in the treatment group were administered with puerarin after the cerebral IRI model was established） by random number table method. All rats were sacrificed 24 h after operation. The neurological function of rats was evaluated by Zea-Longa method. The denatured cell index （DCI） in cerebrum was observed by HE staining. Main components of renin-angiotensin system including angiotensinⅡ （AngⅡ）， angiotensin converting enzyme （ACE）， angiotensin type 1 receptors （AT1R） and angiotensin type 2 receptors （AT2R） were determined using radioimmunoassay， Real-time PCR and Western blot. Results The neurological function scores， DCI， AngⅡ， ACE， AT1R and AT2R in the model group and the treatment group rats increased significantly compared with those in the control group （P < 0.05）. The neurological function scores and DCI after puerarin treatment were decreased significantly compared with those in the model group （P < 0.05）， in the meantime， the main components of renin-angiotensin system were also inhibited by puerarin （P < 0.05）. Conclusion The protective effect of puerarin on cerebral IRI in rats may have certain relationship to the inhibitory of the local RAS in cerebrum.

[Key words] Cerebral ischemia reperfusion injury； Puerarin； Renin-angiotensin system

葛根素是提取于豆科葛屬植物野葛的干燥根中的異黃酮類化合物。研究表明葛根素對腦缺血再灌注損傷（IRI）具有很好的保護作用[1-4]，但對于其作用機制并未完全闡明。組織局部腎素-血管緊張素系統（RAS）是近幾年被人們發現的，與全身RAS具有相同組分，但相對獨立的調控系統，同樣包括血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素Ⅱ 1型和2型受體（AT1R和AT2R）和血管緊張素轉化酶（ACE）[5]。研究表明葛根素對心肌局部RAS的抑制作用是其保護心肌損傷的主要機制之一[6]。而局部RAS同樣存在于腦組織中，并且參與了腦IRI的發病過程[7]。但關于葛根素對腦IRI的保護作用是否與局部RAS有關，目前尚不十分清楚。本研究將利用大鼠腦IRI模型，通過分子生物學來驗證葛根素對腦IRI的保護作用是否與局部RAS有關。endprint

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組

選取8周齡雄性SPF級Wistar大鼠60只，體重200～250 g，購自青島市藥品檢驗所實驗動物中心[SCXK（魯）20100010]。將大鼠按照隨機數字表法分為三組，即對照組、模型組和治療組，每組20只。模型組采用線栓法[8]制造腦IRI模型，即缺血2 h/再灌注22 h模型，術后2 h采用Zea-Longa神經行為學評分法[9]對大鼠的神經功能進行評分，得分在1～3分之間代表模型成功，可將大鼠納入后續研究，否則將大鼠剔除研究。在治療組中，造模成功的同時按照100 mg/kg的劑量給予大鼠腹腔注射葛根素（山東方明藥業股份有限公司，生產批號：1611187）。對照組未給予大腦中動脈栓塞。術后24 h再次給予大鼠神經行為學評分，然后處死。本研究通過青島大學附屬醫院動物實驗倫理委員批準。

1.2 HE染色

4%多聚甲醛固定大鼠腦組織，然后常規石蠟包埋，切片。將石蠟切片依次經二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木精和伊紅染色，并再次經乙醇脫水、二甲苯透明，最后用中性樹膠固定封片。顯微鏡（Leica DMI4000B，德國）下對同一部位進行觀察，并計算變性細胞指數（denatured cell index，DCI）。具體公式如下：DCI=變性細胞數/細胞總數。

1.3 AngⅡ濃度測定

將大鼠腦組織勻漿，并用BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術有限公司）測定蛋白濃度，調整蛋白濃度一致。其余步驟按照AngⅡ放射免疫試劑盒（北京北方生物技術研究所）說明書操作。每個樣本設置3個復孔。

1.4 ACE活性測定

按上述方法提取大鼠腦組織蛋白，然后將蛋白勻漿與ACE的底物-馬尿酸甘氨酰甘氨酸混勻，37℃水浴30 min，用乙酸乙酯提取混合液中的馬尿酸成分，并用氯化鈉充分溶解中，最后用紫外分光法測定混合液中馬尿酸量，從而間接測定腦組織內ACE活性。其活性單位為每分鐘nmol/mg蛋白。每個樣本設置3個復孔。

1.5 Real-time PCR分析

RNA提取試劑盒（陜西先鋒生物科技有限公司）提取組織內總RNA，反轉錄試劑盒（Fermentas，加拿大）將RNA反轉錄成cDNA。選用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR試劑盒（Takara公司）于熒光定量PCR擴增儀（Bio-Rad，美國）進行擴增分析。具體引物序列見表1。每個樣本設置3個復孔，并利用2-ΔΔCt的方法對目的基因的表達進行分析。

1.6 Western-blot分析

按上述方法提取大鼠腦組織蛋白，然后按常規方法依次進行蛋白變性、凝膠電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉，然后加入抗大鼠AT1R（Santa Cruz，美國）、AT2R（Abcam，美國）和ACE（Abcam，美國）抗體4℃過夜。第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育2 h，然后顯影。用GAPDH（Santa Cruz，美國）作為內參，采用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件對蛋白表達進行半定量分析。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠神經行為學評分比較

術后2 h大鼠神經行為學評分發現，模型組12只大鼠造模成功[評分1～3分，平均（2.17±0.83）分]，治療組13只大鼠造模成功[評分1～3分，平均（2.23±0.83）分]，差異無統計學意義（P > 0.05）。術后24 h大鼠神經行為學評分發現，治療組大鼠的神經行為學評分[評分1～2分，平均（1.31±0.48）分]明顯低于模型組[評分1～3分，平均（1.92±0.79）分]，差異有統計學意義（P < 0.05）。對照組大鼠死亡2只，術后2 h和24 h評分均為0分。

2.2 大鼠腦組織病理學結果

HE染色結果顯示，模型組大鼠腦組織內可見細胞排列紊亂，胞核固縮，細胞形態不完整；而治療組大鼠腦組織區內病變細胞的數量明顯低于模型組；對照組大鼠腦組織內細胞基本完整（圖1）。通過對三組大鼠腦組織DCI比較發現，模型組和治療組大鼠腦組織的DCI明顯高于對照組（均P < 0.05）；而治療組大鼠腦組織的DCI較模型組明顯降低（P < 0.05）（表2）。

2.3 大鼠腦組織AngⅡ濃度和ACE活性的比較

模型組和治療組中大鼠腦組織AngⅡ濃度和ACE活性較對照組明顯升高（均P < 0.05）；治療組大鼠腦組織中AngⅡ濃度和ACE活性較模型組明顯下降（P < 0.05）（表3）。

2.4 大鼠腦組織ACE、AT1R和AT2R蛋白和mRNA水平的比較

模型組和治療組大鼠腦組織ACE、AT1R和AT2R的蛋白和mRNA表達較對照組均明顯升高（均P < 0.05）；治療組大鼠腦組織ACE、AT1R和AT2R的蛋白和mRNA表達較模型組均明顯下降（均P < 0.05）（圖2、表4～5）。

3 討論

近年來，隨著人們對RAS的研究，發現RAS不僅存在于全身內分泌循環系統，它也在于局部組織器官中，包括心臟、腎臟和肺臟等。存在于局部組織器官中的RAS，即為組織局部RAS。組織局部RAS是與全身RAS具有相同組分，但相對獨立的調控系統，并且它在組織器官中發揮著特有的生物學作用[5]。

最近報道，腦組織中同樣存在著局部RAS，并且參與了腦缺血性再灌注損傷的病理過程[10-13]。Nakagawa等[10]發現，過度激活RAS通過增加炎癥因子和細胞凋亡，進而引起腦損傷。還有學者[11]發現，過度激活的RAS可通過氧化應激增加腦損傷，而AT1R阻斷劑可以抑制氧化應激，進而保護腦組織。Zhang等[12]學者證實，激活的腦組織局部RAS可通過促進 C-JUN氨基末端激酶的表達，進而促進腦細胞凋亡，而AT1R阻斷劑可以減少細胞凋亡，從而改善腦IRI。本研究發現模型組大鼠在發生腦IRI的同時，腦組織局部RAS的主要組分均明顯升高。綜上所述，目前的研究和本研究均表明，組織局部RAS不僅存在于腦組織中，而且在腦IRI中發揮重要作用。endprint

研究表明葛根素具有明顯抑制RAS的作用[14]。吳黎明等[15]發現，葛根素通過NF-κB信號通路抑制心肌組織局部RAS的表達，進而保護心肌IRI。郭亞東等[16]發現，葛根素聯合替米沙坦通過抑制RAS的過度激活，進而減輕肥胖和改善胰島素抵抗。高靜媛等[6]發現，葛根素通過抑制糖尿病大鼠RAS，進而發揮對心臟的保護作用。這些研究均已表明葛根素可以通過抑制組織局部RAS的激活，進而發揮其生物學療效，而葛根素對腦IRI的保護作用已是不爭的事實[1]，其機制包括減輕興奮性氨基酸毒性[17-18]、減輕炎性反應[19-20]、抑制細胞凋亡[21]和減輕腦水腫[4]等。但是，葛根素對腦組織局部RAS的抑制作用是否也是其保護腦組織的機制之一，目前尚不十分清楚。

本研究發現給予葛根素干預后，治療組大鼠的腦IRI較模型組明顯減輕，同時伴有腦組織局部RAS主要組分明顯降低，這提示葛根素治療大鼠腦IRI的作用可能與其抑制腦組織局部RAS有關，為葛根素治療大鼠腦IRI提供了新的可能機制。

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（收稿日期：2017-10-04 本文編輯：張瑜杰）endprint