腎癌組織中卷曲螺旋結構域蛋白62的HLA-A2表位肽的篩選和鑒定

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(1.鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450001)

腎癌在全球惡性腫瘤之中占3%,發病率和病死率均較高[1]。而且,腎癌對于化療和放療的治療效果都不太理想，并且尚未發現十分有效的輔助治療方法。細胞毒性T細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)是淋巴細胞的一種，這種淋巴細胞就是專門的CD8+T細胞,這種特定類型的免疫淋巴細胞可以消滅另一種特定的細胞。CTL在與腫瘤研究相關的領域里面發揮著獨特的意義。能消滅另一種特定細胞的關鍵就在一種特殊的復合物。這種復合物的特點就是抗原肽和目的腫瘤細胞表面的主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ合在一起，從而才能被CD8+T細胞發現進而發生消滅腫瘤細胞的行為。卷曲螺旋結構域蛋白62(coiled-coil domain containing patients 62， CCDC62)是一種腫瘤-睪丸抗原。正常的機體組織中，僅能在睪丸組織中檢測到CCDC62的mRNA表達，但在結直腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌等腫瘤組織中也有一定的表達[2]。目前，用于治療各種腫瘤的肽疫苗正處于臨床研究的活躍階段。抗原肽需要針對特定的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分型進行預測。在我國人群中，HLA-A2的分型占到了45%左右。因此，針對HLA-A2的表型預測有著很重要的意義[3]。本研究通過NetCTL1.2軟件進行生物信息學綜合預測，篩選出得分較高的抗原表位，并進一步進行CCDC62表位肽表位的篩選和鑒定。

1 材料與方法

1.1材料T2A2細胞由鄭州大學生命科學學院實驗室常規保存，采用體積分數5% CO2、37 ℃條件下常規培養。外周血單個核細胞采集自鄭州大學第一附屬醫院的腎癌患者，所有病例均經病理學檢查確診。該研究已經獲得了鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1 HLA-A2分型表位肽的預測 用NetCTL 1.2網站(http://www.cbs.dtu.dk /services /NetCTL/)對目的癌睪抗原CCDC62進行序列的預測和分數評定。根據分數情況，選擇得分大于1.0的表位肽進行合成。

1.2.2 HLA-A2限制性CTL表位肽的合成和鑒定 課題組根據得分選定的表位肽委托鄭州派和泰德醫藥科技有限公司來進行制作合成，并且通過進行高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)的分析與純化步驟之后，這些肽的純度>95%。并且通過HPLC檢測之后，這些抗原肽的相對分子質量與理論值相符合，可以進行下一步的實驗。

1.2.3 HLA-A2分子與合成后的表位肽進行結合力實驗 培養T2A2細胞至生長旺盛的時期，用伊思柯夫改良培養基 (Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM)洗滌3遍，細胞密度調為 2 ×106·L-1，加入48孔板。每孔加入肽和β2-微球蛋白的量為25 μg、0.25 μg。在體積分數5% CO2、37 ℃條件下培養18 h以后，使用預冷的PBA溶液再次洗滌3遍，每個樣品加入0.5 μL的抗人HLA-A2抗體。在4 ℃冰箱里面不被光照的條件下經過30 min，用PBA溶液洗滌再上流式細胞儀檢測，結果用熒光系數(flourescence index，FI)表示。FI=(表位肽平均熒光強度-背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度。高等結合是FI>1.0，中等結合是FI為0.5～1.0之間，低結合是FI<0.5[4]。

1.2.4 CTL的誘導 對來自腎癌患者的20 mL外周血進行分類，加入抗體后經流式細胞儀進行篩選檢測，結果證明為HLA-A2陽性后。配制含有淋巴細胞分離液的混合溶液然后通過密度梯度離心的方法，收集培養外周血單個核細胞。培養基是含有體積分數10%胎牛血清的IMDM培養基，在24孔板中培育時的細胞濃度調為2×106·L-1。第1天后每孔加入肽50 mg·L-1、β2-微球蛋白0.5 mg·L-1。第3天，加30 u·mL-1的重組人白介素-2,間隔1 d加重組人白介素-2，刺激周期1周。第2輪的誘導從第8天開始，重復第1輪的操作，但是要在第3天加入CD3刺激性抗體。刺激3輪后，培養至21 d，收集細胞。經過以上過程的細胞就是效應細胞，即CTL。實驗中需要的靶細胞是荷肽的T2A2細胞，用無血清的IMDM培養基來調細胞密度。

1.3數據分析流式細胞儀得出的數據結果用FlowJo軟件進行分析，并用GraphPad Prism軟件制圖和分析結果。

2 結果

2.1CCDC62的HLA-A2限制性表位的預測結果依據NetCTL1.2軟件的結果，選擇得分>1.0的表位肽。見表1。

表1 CCDC62的HLA-A2限制性表位預測結果

2.2表位肽與HLA-A2分子結合力實驗結果使用流式細胞儀進行檢測，對所得到的數據進行處理，結果表明CCDC62-P137和CCDC62-P141這2條肽都有較好結合力(FI>1.0)。見表2。

表2 候選肽與HLA-A2分子的結合力結果

2.3細胞內因子染色實驗來檢測T細胞釋放IFN-γ的水平細胞內因子染色檢測表位肽誘導外周血單個核細胞產生IFN-γ+CD8+T細胞的比例。負載抗原肽(50 mg·L-1)的T2A2細胞作為靶細胞，效應細胞來自抗原肽(10 mg·L-1)體外誘導的腎癌患者外周血單個核細胞。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代作為本實驗的空白對照組，HBcAg18-27替代作為本實驗的陰性對照組。表位肽P137相對于對照組能激發產生更多的IFNγ+CD8+T細胞。見圖1。

3 討論

腎癌這種腫瘤疾病對廣泛用于其他腫瘤疾病的放療和化療的效果都沒有較好的反饋。如今，分子免疫學和生物信息學在不斷發展，為我們通過免疫治療方法治療惡性腫瘤提供了支持和保障。目前，腫瘤的免疫治療是腫瘤的研究熱點和前沿方向[7-8]。

圖1 腎癌患者外周血單個核細胞經過CCDC62

腫瘤疫苗的研究為腫瘤的治療和預防提供了新的思路和方法，并且近幾年有著極大的進步與發展[9]。腫瘤疫苗的原理是用患者本體的免疫細胞來殺傷腫瘤細胞。因此，與放療和化療比較，有著極大的優勢，且治療方案所導致的不良事件明顯減少，且癥狀也減輕[10]。腫瘤細胞的表面有多種抗原肽，這些抗原肽可以特異性激發免疫細胞的應答反應[11]。

使用生物信息學預測腫瘤的抗原表位，可以更加有針對性，且能夠縮短實驗周期，提高實驗效率。NetCTL 1.2既有MHC分子根據位點結合多肽的原理，并有CTL表位和其源蛋白組成的數據集，因此有較高的預測準確性[12]。

在本次研究中，使用腎癌患者的外周血，簡化了體外實驗及體內實驗2次驗證的步驟，同時也縮短了實驗時間，并且所采取的方案和所得結果具有更高的參考價值[13]。本課題組后期的工作就是進一步拓展研究的范圍，一方面查找新的抗原，合成驗證新肽的活性；另一方面，對現有的表位肽進行改造加工，增強其活性。并且本課題組將繼續擴大樣本量，進行表位肽活性的驗證。