核因子-κB抑制物激酶ε促進人腦膠質母細胞瘤惡性進展的實驗研究

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(1. 鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001; 2.河南省人民醫院藥學部，河南 鄭州 450003； 3.天津醫科大學總醫院，天津 300070)

核因子-κB抑制物激酶ε(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit epsilon，IKKε) 是IKK家族成員，可以通過核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路調控腫瘤的侵襲和遷移能力[1]。研究[2-4]表明，IKKε在人腦膠質瘤中高表達，并與病理分級相關，抑制IKKε表達后，可顯著降低膠質瘤的侵襲和遷移能力。但IKKε通過IKKε-YAP1-miR-Let-7b/i途徑促進人腦膠質母細胞瘤惡性進展的相關研究尚未見報道。本研究在U87-MG細胞中分別調控IKKε及YAP1的表達水平，進而檢測IKKε、YAP1及miR-Let-7b/i的表達水平，以探究IKKε通過IKKε-YAP1-miR-Let-7b/i途徑促進膠質母細胞瘤的惡性進展的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑IKKε短發夾核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid，shRNA)慢病毒序列為5′-GCATCATCGAACGGCTAAATA-3′，無義序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′，由上海吉凱公司合成；YAP1小干擾RNA(small interfere ribonucleic acid，siRNA)由廣州銳博公司設計合成；IKKε上游引物為5′-GAGAAGTTCGTCTCGGTCTATGG-3′,下游引物5′-TGCATGGTACAAGGTCACTCC-3′；YAP1上游引物為5′-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3′,下游引物5′-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3′；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-Let-7b/i及U6反轉錄引物及PCR引物均由廣州銳博公司設計合成；人腦膠質母細胞瘤細胞株U87-MG購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。DMEM培養基(美國Gibco公司)，RT-PCR定量檢測試劑盒(美國Promega公司)，轉染試劑Lipofectamine 3000 (美國Thermo Fisher Scientific公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或抗鼠二抗及小鼠抗GAPDH抗體(北京中杉金橋生物工程有限公司)，抗IKKε抗體、抗YAP1抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2細胞培養、病毒轉染和siRNA轉染U87-MG細胞采用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱培養。轉染前以3×105個/孔種于6孔板內，加2 mL完全培養基，過夜。次日稀釋病毒，按1 μL/孔IKKε shRNA慢病毒原液稀釋至6 mL完全培養基中并添加終濃度為5 μg·mL-1的聚凝胺，移去孔中培養基，按1 mL/孔添加稀釋后的病毒液，同時建立對照，培養箱繼續培養過夜，24 h后移去病毒液，加入2 mL完全培養基，繼續培養48 h以進行后續實驗。細胞種于6孔板內，細胞密度至70%～80%時，采用Lipofectamine 3000轉染試劑按照說明書進行YAP1 siRNA轉染，同時建立對照。

1.3Westernblot檢測IKKε與YAP1表達RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，冰浴90 V轉膜90 min。室溫封閉2 h，一抗(IKKε 11 000稀釋，YAP1 11 000稀釋，GAPDH 11 000稀釋),4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫1 h后，PBST洗5 min，3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，PBST洗5 min，3次，將發光液加至聚偏氟乙烯膜上，曝光，凝膠成像系統采集圖像。

1.4RT-PCR檢測IKKε、YAP1及miR-Let-7i/b表達Trizol裂解細胞，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA， RT-PCR擴增，以GAPDH、U6為參照。擴增體系20 μL，包括PCR buffer 10 μL，雙蒸水7 μL，目的基因合成引物2 μL，cDNA 1 μL。反應條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，55 ℃、40 s，共40個循環；72 ℃延伸5 min。PCR結果判定采用2-ΔΔCT法。實驗結果以GAPDH為內參照，計算IKKε、YAP1 mRNA的相對表達水平;以U6為內參照，計算miR-Let-7i/b的相對表達水平。各組均設復孔3個，重復實驗3次。

1.5Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲能力Transwell上室中加入13(基質膠DMEM)稀釋的基質膠60 μL，37 ℃下30 min使其凝膠。下室加入600 μL含血清培養基。待檢細胞用無血清培養基制成細胞懸液，上室中加入5×104個細胞，24 h后棄上室液體，質量分數4%多聚甲醛固定15 min，棉簽擦去上室未過膜細胞，結晶紫染色10 s，倒置上室顯微鏡下觀察成像。

2 結果

2.1轉染IKKεshRNA對YAP1及miR-Let-7b/i表達的影響與對照組和無義序列組相比較，轉染IKKε shRNA組IKKε蛋白及mRNA水平明顯降低，YAP1蛋白水平明顯降低，miR-Let-7b/i水平明顯升高(P均<0.05)。見圖1。

2.2YAP1抑制miR-let-7b/i表達與對照組和無義序列組相比較，轉染YAP1 siRNA組YAP1蛋白及mRNA水平明顯降低；miR-Let-7b/i水平明顯升高(P均<0.05)。見圖2。

2.3轉染IKKεshRNA抑制細胞遷移和侵襲情況與對照組和無義序列組相比較，轉染IKKε shRNA組穿過小室細胞數明顯降低(P均<0.05)。見圖3。

圖1 U87-MG細胞轉染IKKε shRNA慢病毒后IKKε、YAP1及miR-Let-7b/i水平變化

A、B：轉染IKKε shRNA慢病毒后，IKKε蛋白及mRNA水平的變化；C、D：轉染IKKε shRNA慢病毒后，YAP1蛋白及mRNA水平的變化；E、F：轉染IKKε shRNA慢病毒后，miR-Let-7b/i表達水平的變化

圖2 U87-MG細胞轉染YAP1 siRNA后YAP1及miR-Let-7b/i水平變化

A、B：轉染YAP1 siRNA后YAP1蛋白及mRNA水平的變化；C、D：轉染YAP1 siRNA后，miR-Let-7b/i表達水平的變化

3 討論

IKKε在膠質瘤中明顯高表達，并與膠質瘤的病理分級有關[5]。IKKε可體外調控膠質瘤細胞的增值、遷移和侵襲，并在體內促進膠質瘤的形成[3, 5]。IKKε主要影響NF-κB等通路[6-10]。本實驗發現IKKε能調控YAP1的表達，而YAP1是Hippo通路下游的重要因子,并且YAP1入核可促進膠質瘤的進展[11]。同時，實驗發現敲低IKKε后YAP1的mRNA水平沒有明顯變化，而蛋白水平明顯降低，說明IKKε調節YAP1不是在轉錄水平，而是在轉錄后的翻譯修飾水平。

YAP1是重要的轉錄因子，主要通過Hippo通路發揮轉錄激活作用[12-13]。研究[14-17]表明，LIN28是一種RNA結合蛋白，可結合miR-Let-7家族前體的終端環，阻斷其成熟，因此增強致癌性。Chaulk等[18]研究發現在乳腺癌中YAP1能通過調節LIN28-Let-7軸降低成熟Let-7的表達，但抑制YAP1的表達可降低LIN28的蛋白量，而其mRNA無明顯改變，由此說明YAP1調控LIN28是通過轉錄后修飾。因此,YAP1調控miR-Let-7表達是在轉錄后，而不是在轉錄水平。本實驗通過敲低YAP1后檢測miR-Let-7b/i的變化證明了這個結論。

圖3 Transwell實驗結果

A、B：Transwell上室未加基質膠條件下，各組細胞穿膜情況(×200)，反映各組細胞遷移能力情況；C、D：Transwell上室加基質膠條件下，各組細胞穿膜情況(×200)，反映各組細胞侵襲能力情況

在多種類型腫瘤中，發現miR-Let-7家族是重要的腫瘤抑制因子，miR-Let-7能夠通過多種通路抑制膠質瘤細胞系的增殖、遷移和侵襲。Johnson等[19]研究發現ras基因包括H-ras、K-ras和N-ras，在細胞進程中這些因子都受miR-Let-7負調控。Shi等[20]研究報道高遷移率族蛋白A2是癌基因，在子宮平滑肌肉瘤中是miR-Let-7的下游靶基因。Wang等[21]發現miR-Let-7a通過抑制信號傳導及轉錄激活因子3影響肝癌的發生。總之，這些研究數據表明miR-Let-7家族在惡性腫瘤中扮演重要角色。因此，miR-Let-7b/i可能成為靶向治療膠質瘤的新的靶點。

綜上所述，敲低IKKε后可降低YAP1蛋白表達，但是不影響YAP1 mRNA的表達，增加miR-Let-7b/i的表達。然后，關于YAP1對miR-Let-7b/i的影響的研究顯示，敲低YAP1后miR-Let-7b/i表達升高。因此，IKKε可通過IKKε-YAP1-miR-let-7b/i通路促進膠質母細胞瘤的發展，阻礙該通路可能是治療膠質母細胞瘤的一種新的治療策略。