清肺養(yǎng)陰方治療大鼠放射性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

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(1. 濰坊市中醫(yī)院放療中心，山東 濰坊 261041；2. 濰坊市中醫(yī)院婦科，山東 濰坊 261041)

放射性肺損傷是放療常見的并發(fā)癥之一，在胸部腫瘤放療后，正常肺組織受到照射而發(fā)生的一系列動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，主要包括放射性肺炎和放射性肺纖維化[1-2]，輕者無癥狀，炎癥可自行消散；重者肺臟發(fā)生廣泛纖維化，肺組織變硬，容積縮小，肺彌散量降低，引起低氧血癥。加之病變部位抗感染能力下降，易導(dǎo)致反復(fù)感染，病情進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致肺心病，引起呼吸衰竭，預(yù)后不佳，在尚無特效治療方法的今天，運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合獨(dú)特的理論對(duì)其進(jìn)行病因及治療的探討具有積極意義。

中醫(yī)藥在放射性肺損傷的治療中有一定療效[3]。本研究以中醫(yī)辨證理論為指導(dǎo)，探討中藥清肺養(yǎng)陰方對(duì)放射性肺損傷大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級(jí)Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量(180±20)g，由山東魯抗醫(yī)藥公司提供。

1.2藥品與試劑清肺養(yǎng)陰方(由太子參20 g、麥冬20 g、半夏10g、枇杷15 g、川貝母10 g、玄參12 g、知母12 g、生地15 g、南北沙參各10 g、桔梗10 g、苦杏仁10 g、前胡9g、魚腥草20 g、甘草6g組成)所需湯劑由濰坊市中醫(yī)院提供。制作嚴(yán)格按照傳統(tǒng)中藥方法煎煮，后醇沉、濃縮成含生藥0.8 g·mL-1湯劑備用。試劑：TNF-α、TGF-β、IL-6及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器PRIMUS直線加速器(德國Siemens公司)、1/10萬電子天平(日本Shimadzu公司)、電熱式干燥箱(江蘇啟東實(shí)驗(yàn)儀器廠)、特制小動(dòng)物開胸器(北京醫(yī)用儀器廠)、CK2顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4動(dòng)物分組及造模選取60只健康Wistar大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、研究組，每組20只。模型組、研究組大鼠放射性肺損傷模型制作參照文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行。先將大鼠麻醉后排列固定，確保胸部處于暴露狀態(tài)，用鉛板將頭部和腹部進(jìn)行遮擋，用6 MV-X線直線加速器進(jìn)行雙肺前后兩野對(duì)穿照射，給予單次照射劑量15 Gy；吸收劑量率200 cGy·min-1，源皮距98.5 cm(大鼠胸部體厚3 cm)，照射后將大鼠按照原條件繼續(xù)喂養(yǎng)，無大鼠死亡。

1.5給藥劑量及方法大鼠稱重后，按照大鼠體質(zhì)量，研究組每天10 mL·kg-1灌胃服用中藥，空白組、模型組每天蒸餾水10 mL·kg-1灌胃，各組均于照射后第1天開始灌胃用藥，每天1次，連續(xù)灌胃至照射后滿6周，每周按大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整1次灌胃給藥劑量。

1.6實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的收集及處理分別在完成照射第1周、第2周、第3周、第4周、第5周，3組各隨機(jī)抽取4只大鼠處死。將各組大鼠予質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔麻醉后，取5 mL腹主動(dòng)脈血于試管中，用低溫離心機(jī)以3 000 r·min-1離心10 min取血清，用ELISA法檢測血清細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β和IL-6水平(所有檢測均嚴(yán)格按說明書流程操作)；隨后斷頸處死大鼠，開胸并迅速取出肺臟，全肺均在氣管頸部環(huán)甲膜處離斷，將大鼠右上肺組織固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液中，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，經(jīng)HE染色后光鏡下觀察病理改變。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠肺組織病理學(xué)改變空白組大鼠未見肺部炎癥反應(yīng)；模型組大鼠于第1周便出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)，第4周炎癥反應(yīng)最為顯著；研究組第4周大鼠肺組織放射性肺炎反應(yīng)較模型組明顯減輕。

2.2各組大鼠血清中TNF-α、TGF-β和IL-6水平變化與空白組比較，模型組、研究組大鼠血清中TNF-α、TGF-β和IL-6水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與模型組比較，研究組血清中TNF-α、TGF-β和IL-6水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1～3。

表1 各組大鼠血清TNF-α水平比較 ng·L-1

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

表2 各組大鼠血清TGF-β水平比較 ng·L-1

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

表3 各組大鼠血清IL-6水平比較 ng·L-1

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

3 討論

放射性肺損傷是放療常見并發(fā)癥之一，發(fā)生率為15%～20%，其不僅影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可并發(fā)呼吸衰竭而導(dǎo)致患者死亡。

放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前認(rèn)可度較高的主要有3種[6-8]:靶細(xì)胞理論、細(xì)胞因子學(xué)說、自由基學(xué)說。細(xì)胞因子學(xué)說方面，國內(nèi)外研究[9]證實(shí)，大量炎癥因子在放射性肺損傷的形成過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，TNF-α、TGF-β及IL-6在照射后4周的大鼠血清中水平最高，應(yīng)用清肺養(yǎng)陰方能明顯降低模型大鼠TNF-α的表達(dá)，對(duì)急性炎癥產(chǎn)生抑制作用，減少炎性滲出，促進(jìn)炎癥吸收，從而使肺組織的炎癥反應(yīng)明顯減輕。TGF-β在促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂方面能夠發(fā)揮很好的作用，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的不斷分裂與分化成熟，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的生成。IL-6是一種多肽蛋白，其可來源于肺內(nèi)多種活性細(xì)胞，諸如肺泡巨噬細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮、T淋巴細(xì)胞等。IL-6可通過誘導(dǎo)肺內(nèi)成纖維細(xì)胞釋放盡可能多的急性期蛋白成分，以促進(jìn)非特異性的炎癥反應(yīng)。檢測血清中IL-6可用于判斷肺組織的炎癥狀態(tài)。

放射性肺損傷屬于中醫(yī)“咳嗽”、“喘證”、“肺痿”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為放射線為熱毒之邪，表現(xiàn)出咳嗽、胸悶、胸痛、低熱等癥狀。放射性肺損傷的病因?yàn)榛鹦埃鬃苽梭w津液，損耗正氣和陰血。因此，針對(duì)火邪的致病特點(diǎn)，對(duì)本病的防治重在養(yǎng)陰潤肺，固護(hù)脾胃之氣。因此清養(yǎng)肺胃之氣陰為本病用藥的主要治療原則。中醫(yī)在治療放射性肺炎上以整體觀念為指導(dǎo)，注重辨證論治。

用于本研究的清肺養(yǎng)陰方由太子參、麥冬、半夏、枇杷、川貝母、玄參、知母、生地、南北沙參、桔梗、苦杏仁、前胡、魚腥草、甘草組成。組方中魚腥草有清熱解毒之功效，《本草經(jīng)疏》中“魚腥草”條曰:“治痰熱壅肺，發(fā)為肺癰吐膿血之要藥”。與麥冬、生地、沙參共奏清熱解毒、養(yǎng)陰生津之功，是為君藥；川貝母、苦杏仁清肺化痰、降氣止咳為臣藥；桔梗、前胡一升一降，宣肅肺氣，止咳化痰，共為臣藥；佐以枇杷潤肺止咳，玄參、知母清熱養(yǎng)陰，半夏下氣化痰，同時(shí)有和胃降逆之功，酌情添加太子參益氣扶正，甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏益氣生津、宣肺化痰、止咳定喘之功效。

放射性肺損傷是一個(gè)多細(xì)胞參與、多細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜病理過程，從本研究結(jié)果可知，清肺養(yǎng)陰方能夠防治放射性肺損傷的發(fā)生，其機(jī)制就是抑制大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β及IL-6的表達(dá)，這在相關(guān)研究中也得到了證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，該方劑在抑制炎癥、抑制纖維化因子表達(dá)方面有一定效果，可能與其對(duì)TNF-α、TGF-β及IL-6基因表達(dá)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響有關(guān)，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。