缺氧誘導因子-1α、葡萄糖轉運蛋白-1和碳酸酐酶-Ⅸ在子宮內膜癌患者中的作用

(安陽市婦幼保健院婦產科，河南 安陽 455000)

子宮內膜癌是發達國家女性最常見的生殖器惡性腫瘤，發病風險為2%～3%[1]。子宮內膜癌自然病程緩慢，預后較好，臨床癥狀的早期出現使我們能夠在疾病的早期進行診斷。子宮內膜癌患者的5 a總生存率很高，在所有階段占80%以上，其中在第一階段占90%以上[2]。預后不良的患者，會受益于進一步的輔助化療或放療。因此更多了解預測復發和(或)死亡的重要風險因素是非常有意義的。

目前公認的子宮內膜癌預后較差的因素是：臨床分期晚期、非子宮內膜組織學亞型、高級別病變(G3)、子宮肌層深部侵犯(>50%)、淋巴結轉移、宮頸受累和淋巴血管間隔侵犯[2]。盡管近年來我們對腫瘤細胞的認識有了很大的提高，但控制腫瘤進展和轉移形成過程的確切機制仍不清楚。

缺氧在癌變中起著重要作用。代謝重編程和基因表達的變化對于適應氧可用性下降是必要的。腫瘤微環境中的缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)是能夠適應缺氧環境的氧敏感轉錄因子。HIF是細胞對應激反應的重要介質，如代謝性、缺氧性和炎癥性。腫瘤發生過程中發生代謝改變，部分是在缺氧和HIF調節下發生的。此外，低氧是繼發于低氧的炎癥信號和過濾清除了腫瘤進展的驅動因素[3]。然而，盡管低氧在腫瘤微環境中的作用已被證實，但其在子宮內膜癌中的意義還不完全清楚。HIF-1是哺乳動物幾乎所有核細胞氧平衡的關鍵調節因子[3-4]。免疫組織化學研究[5]表明，許多惡性腫瘤的特征是與正常組織相比，HIF-1出現過度表達。對細胞氧水平變化的適應主要由HIF-1的α亞單位決定。低氧條件下，活性因子HIF-1參與葡萄糖代謝、pH值、血管生成、細胞分化、遷移和轉移形成的調節[6]，腫瘤微環境中葡萄糖代謝由氧線粒體過程轉變為糖酵解(Warburg效應)。HIF-1調節葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter，GLUT)中GLUT-1和GLUT-3的活性，這些轉運蛋白負責葡萄糖的攝取[7]。GLUT-1的表達被缺氧以一種依賴于HIF-1α的方式調節[8]。碳酸酐酶-Ⅸ(carbonic anhydrase-Ⅸ，CA-Ⅸ)是另一個與HIF-1α活性相關的因素[9]。CA-Ⅸ對腫瘤微環境的影響以調節pH為特征。CA-Ⅸ的過度表達在許多腫瘤組織中觀察到，但在正常組織中沒有觀察到[10]。本研究的目的是驗證HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ免疫組化測定蛋白作為子宮內膜癌患者不良臨床病理特征預測因子的有效性，以及分析蛋白表達與患者生存的關系。

1 材料與方法

1.1一般資料入組2013年1月至2017年12月期間我院收治的經病理學確診的92例子宮內膜癌患者，年齡37～84(65.1±9.5)歲，根據刮宮標本對子宮內膜癌進行診斷后，所有患者均行腹部子宮切除術、雙側輸卵管卵巢切除術和盆腔淋巴結切除術，患者的基本臨床資料見表1。根據上述的風險因素，所有患者分為3組：低風險組：Ⅰa期、G1或G2期、子宮內膜組織病理亞型；中風險組：Ⅰa期G3級、Ⅱ期和非子宮內膜樣組織病理亞型；高風險組：非子宮內膜樣組織病理亞型、Ⅰb期G3級、Ⅱ期和更高分型及分期。低風險組的患者術后不再接受任何進一步的治療；中風險組術后5周接受近距離放療；高風險組接受遠程放療和近距離放療；對10例非子宮內膜組織病理亞型(化療包括卡鉑和紫杉醇)患者進行輔助化療。

表1 子宮內膜癌患者的一般資料

1.2方法檢測指標應用免疫組化S-P法，蠟塊均由病理科專業技術人員處理制備。實驗操作步驟均按照操作說明嚴格進行。主要試劑：鼠抗HIF-1α單克隆抗體(1100)；兔抗GLUT-1多克隆抗體(1200)和兔抗CA-Ⅸ多克隆抗體(11 500)。石蠟切片脫蠟水化，過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，用含質量分數5%牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)中洗滌。滴加一抗，GLUT-1和CA-IX抗體在室溫下孵育30 min，HIF-1α在4 ℃條件過夜；以DAB(3-3-二氨基聯苯胺)為顯色劑，將抗原抗體復合物定位為棕色反應產物。

1.3免疫組化染色判斷蛋白的表達量根據2個參考進行：1)根據細胞膜及細胞質染色強度進行評分，0分：陰性；1分：低染色；2分：適度染色；3分：強染色；2)陽性細胞或組織面積的百分比，0分：陰性；1分：<10%；2分：10%～<50%；3分：50%～<80%；4分：≥80%。

2 結果

2.1子宮內膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ蛋白表達子宮內膜癌組織中HIF-1α陽性表達率為96.74%，GLUT-1為100.00%，CA-Ⅸ為89.13%。不同臨床分期子宮內膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ的蛋白表達情況見圖1。

圖1 不同臨床分期子宮內膜癌

2.2子宮內膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-IX蛋白表達量與其臨床病理特征之間的關系HIF-1α的表達在子宮內膜癌的組織學亞型之間存在高度差異，HIF-1α的表達越高，復發的風險越高(P<0.05)。見表2～4。

表2 子宮內膜癌組織中HIF-1α蛋白表達與其臨床病理特征之間的關系

表3 子宮內膜癌組織中GLUT-1蛋白表達與其臨床病理特征之間的關系

表4 子宮內膜癌組織中CA-Ⅸ蛋白表達與其臨床病理特征之間的關系

2.3子宮內膜癌組織中HIF-1α、GLUT-1和CA-Ⅸ蛋白表達與其生存之間的關系的COX回歸分析結果單變量COX回歸分析顯示，組織學分級(G3)、淋巴結轉移陽性和侵犯子宮肌層>50%是子宮內膜癌生存危險因素；多變量COX回歸分析顯示，僅侵犯子宮肌層>50%是子宮內膜癌生存危險因素(P<0.05)。見表5、6。

表5 COX單變量分析選擇的總生存率的預后因素

表6 COX多變量分析選擇的總生存率的預后因素

3 討論

缺氧在致癌過程中起著重要作用。然而，盡管低氧在腫瘤微環境中的作用已被證實，但其在子宮內膜癌中的重要性還沒有得到很好的解釋。腫瘤的生長需要不斷增加的氧氣和營養素供應，從而促進新血管系統的發育。通常情況下，腫瘤細胞的生長往往先于血管的發育，而血管的發育是由低氧區的存在所反映出來的，這些區域位于腫瘤周圍，由于增殖增強，也位于其中心部位，血管的穿透不足[11]，缺氧誘導了HIF-1α的合成，導致腫瘤微環境的改變。此外，隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞變得獨立于外部調節因子，并可遷移至供氧的不同區域，因此，假設HIF-1α的表達與抗腫瘤和治療有關，那么這種假設就會刺激對新型藥物的研究，這些藥物可以克服與HIF-1α過度表達相關的治療抵抗[12]。目前有人認為，HIF-1α發揮救世主作用，使細胞發生缺氧。此外，研究[13]還發現，除缺氧外，高水平的HIF-1α也可能是由病毒癌基因刺激所致。

HIF-1α參與月經周期子宮內膜修復，其表達增加與分泌期最相關，在其晚期有峰值表達的報道；此外，HIF-1α被發現是雌激素依賴性血管內皮生長因子合成的共同激活因子[14]。

HIF-1α不僅可以調節正常子宮內膜癌的血管生成，還可以在子宮肌層受到侵犯時釋放血管內皮生長因子[14]。在動物模型中，低氧刺激與前列腺素受體結合，促進子宮內膜癌細胞的增殖和腫瘤的生長[15]。

HIF-1α通過調節p27kip細胞周期抑制劑參與子宮內膜癌的進展[16]。此外，HIF-1α基因多態性的存在與HIF-1α的穩定性和持續激活有關。這種多態性在子宮內膜癌細胞中被記錄為一種新的突變。這種缺陷與較高的血管密度和腫瘤更大的生長潛力有關[16-17]。

激活人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路可使HIF-1α穩定。編碼PTEN基因的突變增強了細胞增殖，增加了細胞周期蛋白的表達和復制。在正常的子宮內膜細胞中，這些細胞是由自身再生引起的。相反，PTEN抑制性轉化功能的失活導致子宮內膜細胞惡性轉化[18]。PTEN抑制基因編碼的蛋白質是一種磷酸酶，負責細胞膜脂質的去磷酸化。此外，PTEN還作為蛋白激酶途徑的抑制劑，抑制了磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase , PI3K)的活性。約83%的子宮內膜癌中表達PTEN蛋白。PI3K/AKT/mTOR通路過度激活可導致肌腱損傷，導致腫瘤生長失控。在子宮內膜癌細胞中，PI3K/Akt/mTOR信號轉導級聯是酪氨酸激酶受體的主要失活途徑之一，如血管內皮生長因子受體1、血小板衍生生長因子受體、表皮生長因子受體1和c-Met[19]。

目前，假設HIF-1α的表達增加，從正常子宮內膜中觀察到的最小值到子宮內膜增生和惡性腫瘤中記錄到的中、高水平。事實上，HIF-1α的表達與腫瘤的臨床分期成比例增加同樣重要。HIF-1α表達的增加伴隨著血管緊張度的增加、血管生成的不穩定；這意味著HIF-1α、血管生成和子宮內膜癌之間的關系[20]。

我們的研究證實了HIF-1α在子宮內膜癌中的表達，與子宮內膜腫瘤相比，HIF-1α抗體在非子宮內膜惡性腫瘤中的表達顯著增高。根據Bokhman的研究，HIF-1α的水平與Bokhman亞型 Ⅱ 型的存在顯著相關，與我們的發現與之前唯一一項分析依賴于Bokhman亞型的HIF-1α表達的研究結果相一致[21]。此外，在Bokhman亞型Ⅰ型子宮內膜癌患者中，HIF-1α的表達增加與不良預后因素的存在相關[21]。

此外，我們觀察到HIF-1α的表達與風險發生率存在高度相關性，HIF-1α的高表達與中、高復發風險關系密切。單變量和多變量COX回歸分析顯示，HIF-1α蛋白的表達是Bokhman分型Ⅱ型的一個重要預測因子，并且與中、高復發風險相關。以往關于HIF-1α腫瘤預后價值的研究結果既沒有結論性，也存在爭議。一些作者認為，HIF-1α的高表達與較短的生存時間和復發時間有關；相反，其他研究者認為HIF-1α與腫瘤患者的預后無關[21-22]。

值得注意的是，我們的研究表明，HIF-1α蛋白的高表達與子宮內膜癌預后較差的Bokhman分型Ⅱ型和更高的復發風險有關；這與有關研究[22]結果一致。

PTEN/mTOR通路參與子宮內膜癌變刺激了對mTOR抑制劑的研究。在雷帕霉素衍生物替西羅莫司的第2階段研究中，有14%的子宮內膜癌患者出現部分反應，而有系統治療史的患者中有4%未接受過化療。此外，69%的既往未經治療的患者和48%的化療后患者病情穩定。然而，本研究并未揭示PTEN蛋白表達或PTEN基因突變與替西羅莫司治療結果之間的關系[23]。目前，其他mTOR抑制劑正在進行先進的子宮內膜癌治療試驗。

HIF-1α的表達會改變葡萄糖從有氧代謝到無氧代謝的過程。GLUT和碳酸氫酶參與了這種改變條件的適應性。GLUT-1葡萄糖轉運體也負責攝取這種糖。GLUT-1的表達在無氧條件下增加，引起代謝性脂肪分解。與此相反，GLUT-1的過度表達證實了各種腫瘤的發生，如食管癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌和乳腺癌[24]。我們的研究也發現，GLUT-1的表達也增加了子宮內膜癌的發生風險。但是，GLUT-1的表達與子宮內膜癌臨床病理特征之間并沒有顯著相關性，這一結論與以前的報道一致，根據這些報道我們發現，GLUT-1的存在是腫瘤轉化的標志[25]。正常子宮內膜中缺少GLUT-1的表達，以及在癌前病變中的弱表達和子宮內膜癌組織中的過度表達表明，GLUT-1在子宮內膜癌發生的早期可溶解。

CA-Ⅸ在缺氧誘導的糖酵解過程中起著重要的作用，在許多腫瘤中觀察到了CA-Ⅸ的過量表達，但在正常組織中卻沒有[10]。我們的研究證實了CA-Ⅸ在子宮內膜癌微環境中的表達增加。然而，這種表達水平與腫瘤的臨床病理特征之間并沒有顯著相關性。這一發現與迄今發表的2項研究結果一致[26-27]。有文獻[26]證實了CA-Ⅸ在子宮內膜癌組織中的表達高于正常子宮內膜組織，并提示CA-Ⅸ參與了與腫瘤轉化相關的葡萄糖代謝的轉移。然而，我們的研究結果表明，測定GLUT-1和CA-Ⅸ的表達對確定子宮內膜癌患者的預后沒有幫助。GLUT-1和CA-Ⅸ參與致癌的早期階段，這表明兩者在良性和惡性腫瘤之間的潛在應用是不可區分的。

總之，HIF-1α在高復發風險組及非子宮內膜樣病理組織亞型中的重要作用表明，該因子的表達可能有助于輔助病理形態學檢查，有助于預測子宮內膜癌患者的預后。