清眩降壓湯對離體大鼠胸主動脈的舒張作用及黃芩苷成分分析

林 珊 ，張 鈴 ，蔡巧燕 ，王 懷 ，陳宏偉 ，彭 軍 ，褚劍鋒

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室，福建 福州 350122）

清眩降壓湯是治療高血壓、缺血性腦血管病、眩暈等疾病的臨床經驗方，具有平肝潛陽、息風、清肝熱、益肝腎等作用，對臨床上高血壓病所致的眩暈、耳鳴、失眠、頭痛等癥狀均有療效［1-3］。清眩降壓湯由天麻、鉤藤和黃芩等十多味中藥組成，主要成分為天麻素、鉤藤堿和黃芩苷等生物活性物質。研究表明，清眩降壓湯能降低自發性高血壓大鼠的動脈血壓，同時降低NO水平，減輕高血壓的腦部損害過程；對心肌重構、腎臟纖維化和血管重構等靶器官的損害均有保護作用，進一步對逆轉血管重構表現出明顯作用［4-9］，但對清眩降壓湯治療高血壓有效成分的分析及其對主動脈血管環的作用未見報道。本文通過離體大鼠胸主動脈血管環實驗，探究清眩降壓湯對血管環的保護作用，并運用超高液相色譜儀分析其主要成分黃芩苷，為清眩降壓湯治療高血壓的臨床研究提供實驗數據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 健康SPF級雄性Wistar大鼠，體

質量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供（許可證號：SCXK（滬）2012-0002）。 置SPF級實驗室中正常喂養，恒溫、恒濕、12 h光照／天，適應性喂養1周后，進行后續試驗。

1.2 實驗藥物 清眩降壓湯生藥材購于福建中醫藥大學附屬第三人民醫院。黃芩苷（B20570 CAS#21967-41-9）購自上海源葉生物科技有限公司，純度經UPLC-DAD（面積歸一法）檢測含量均大于98.0%。

1.3 實驗試劑 戊巴比妥鈉（上海化學試劑進出口公司）；重酒石酸去甲腎上腺素（NE，美國Sigma公司）；乙腈、甲醇（德國MERCK公司）。K-H緩沖液（1L）由 NaCl 115.0 g，KCl 4.7 g，CaCl222.5 g，MgCl21.2 g，NaHCO325.0 g，KH2PO41.2 g 和葡萄糖10.0 g配制而成。

1.4 實驗儀器 Angilent 1290超高液相色譜儀（德國安捷倫公司）；HV1403離體組織器官恒溫灌流系統（成都泰盟科技有限公司）；JH-2肌張力換能器（北京航天醫學工程研究所）；BL-420S生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；HW-500型超級恒溫水浴（成都泰盟科技有限公司）；AR2130電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；CP225D電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-300DB臺式數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 取清眩降壓湯復方藥材210 g，加入10倍量水浸泡0.5 h，水煎煮 1 h，共提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至稠膏，減壓干燥10 h，粉碎，即得清眩降壓湯粉末。藥物最終配置成1 mg／mL，稀釋后進行實驗。

2.2 大鼠胸主動脈環制備 取Wistar大鼠，予2%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈采血處死，迅速開胸分離胸主動脈，置于4℃含95%O2和5%CO2的預飽和K-H緩沖液中，固定血管環兩端，剔凈血管周圍的脂肪組織及結締組織，剪成長度3～4 mm的血管環。取2根不銹鋼微型三角掛鉤從血管環管腔穿過后固定，水平懸掛于20 mL浴漕內，連接張力轉換器，使用BL-420S生物機能實驗系統記錄血管環的張力。浴漕內持續通入95%O2和5%CO2，緩慢調節血管環張力至2 g，37℃下穩定1 h，期間每隔20 min換液一次。

2.3 對血管環的直接作用 取大鼠胸主動脈血管環，隨機分為對照組和清眩降壓湯組。清眩降壓湯組采用累積加藥法每隔 30 min加入藥物，使浴槽內藥物的濃度遞增達到 0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL和1 mg／mL，對照組加入等量的生理鹽水。同時，記錄血管環張力值的變化情況，觀察清眩降壓湯對血管環張力的影響。

2.4 對NE預收縮血管環張力的影響 取大鼠胸主動脈血管環，隨機分為對照組和清眩降壓湯組。對照組和清眩降壓湯組用1×10-6mol／L重酒石酸去甲腎上腺素（NE）預收縮血管環達穩定后，清眩降壓湯采取累積加藥法，每隔30 min加入藥物，使浴槽內藥物的濃度遞增達到 0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL和 1 mg／mL，對照組加入等量的生理鹽水。同時，記錄血管環張力值的變化情況，觀察清眩降壓湯對 NE（1×10-6mol／L）預收縮的胸主動脈環張力的影響。

2.5 UPLC分析清眩降壓湯的成分

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱定黃芩苷對照品適量，加入100%甲醇制備得到濃度為0.05 mg／mL的單一對照品儲備液。

2.5.2 供試品溶液的制備 稱取清眩降壓湯粉末0.2 g，置于具塞三角瓶中，并精密加入100%甲醇10.00 mL，稱重，超聲提取 20 min，放冷，再稱重，用100%甲醇補重后搖勻，取其上清液，0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 Acclaim UPLC RSLC 120 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B）梯度洗脫，進樣量 2 μL，流速 0.400 mL／min，柱溫 30℃，檢測波長 280 nm。

2.5.4 成分分析 取黃芩苷對照品溶液，以吸收峰的峰面積對含量作線性回歸。取清眩降壓湯樣品，分別按“2.5.2項”下制備供試品溶液，按“2.5.3項”下色譜條件，進樣量2 μL，并記錄其色譜峰的峰面積積分值，通過線性回歸方程計算清眩降壓湯中黃芩苷的含量。

2.6 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 清眩降壓湯對胸主動脈血管環收縮的影響清眩降壓湯對血管環的張力并無明顯改變，與對照組比較無顯著差異，結果表明，清眩降壓湯對胸主動脈血管環的靜息張力不具影響，結果見圖1。

3.2 清眩降壓湯對NE預收縮血管環張力的影響加入 NE（1×10-6mol／L）預收縮血管環后，累計加入清眩降壓湯可引起血管環濃度依賴性舒張。清眩降壓湯對NE引起的血管收縮具有一定的舒張作用，與對照組比較，具有顯著性差異（P＜0.05），且濃度越高，舒張作用越明顯，存在量效關系。在NE體系下，清眩降壓湯對血管的最大舒張力達（88.35±2.21）%，結果見圖 2。

圖1 清眩降壓湯對靜息狀態下血管環張力的影響（n＝6）

圖2 清眩降壓湯對NE預收縮血管環張力的影響（n＝6）

3.3 清眩降壓湯成分分析及黃芩苷含量測定 黃芩苷的峰面積積分值與進樣量之間關系的回歸方程為 Y＝11736X＋33.196（R2＝0.999），說明黃芩苷標準品的濃度在0.01～0.1 mg／mL之間能呈良好的線性關系。如圖3所示，A、B分別為黃芩苷及清眩降壓湯的UPLC色譜圖。結果顯示，清眩降壓湯與黃芩苷標準品均在同一時間出峰，表明清眩降壓湯中含有黃芩苷。且與其他色譜峰比較，黃芩苷的相對峰面積最高，是清眩降壓湯中最主要化學成分。經黃芩苷標準曲線回歸方程計算，清眩降壓湯中黃芩苷的含量為0.83 mg／g。結果見圖3和表1。

圖3 標準品及清眩降壓湯的UPLC色譜圖

表1 清眩降壓湯的黃芩苷含量測定

4 討論

高血壓在我國患病率高，已經成為我國數量大的重大慢性疾病之一［10-12］。研究數據表明，血壓的增高，會導致主動脈僵硬度和體質量指數的增加，而主動脈的張力、膨脹性、僵硬度指數的增加又可作為預測收縮壓、舒張壓和脈壓增高的指標，因此主動脈僵硬度增加是預示血壓增高的重要決定因素［13］。長期的壓力負荷過大可引起血管壁張力持續增高，一方面引起主動脈發生外向肥厚性重構；另一方面可導致各種細胞因子變化，從而引起血管舒張功能異常。大動脈是血液流通的主要管道，其管壁肥厚會導致血管的擴張性下降、僵硬度增加，最終影響血管的正常功能［14］。因此，舒張血管、改善高血壓進程中大動脈的損傷程度及修復血管情況是評價抗高血壓藥物的主要療效指標之一［15－16］。

清眩降壓湯是陳可冀院士60余年臨床工作中治療高血壓的驗方，臨床研究中表明治療高血壓療效確切，前期基礎實驗發現清眩降壓湯能顯著抑制自發性高血壓大鼠血壓升高和保護靶器官［5-8］。黃芩是傳統中醫用藥，對溫熱病、高血壓等病具有治療效果，黃芩主要含黃芩苷等黃酮類化合物。在前期預實驗工作中，我們在實驗摸索中發現，黃芩苷可作為清眩降壓湯中的指標成分，其響應值最大，成分分析時色譜峰非常明顯，實驗結果圖3與預實驗結果一致。清眩降壓湯的成分分析中，結果表明黃芩苷為最主要成分之一。有研究報道，黃芩苷對NE和KCl引起的去內皮和內皮完整大鼠胸主動脈環的收縮均有舒張作用［17－18］。 本研究結果顯示，清眩降壓湯能顯著舒張NE誘導內皮完整大鼠胸主動脈血管環的收縮，黃芩苷為清眩降壓湯治療高血壓的主要有效成分之一。

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