石斛合劑序貫法對糖尿病合并肝纖維化大鼠的影響

周 勇，施 紅，林心君，余文珍

（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

據WHO數據顯示1994年糖尿病患者人數為1.2億，2014年全世界有3.87億糖尿病患者，預計到2025年全球將突破40億人［1］。隨著糖尿病發病率不斷攀升，死亡率也隨之升高。眾所周知，在糖尿病的發生發展過程中，并發癥也相繼出現，如視網膜病變、肝腎病變及周圍神經病變等。以往關于糖尿病相關并發癥研究較多，近幾年T2DM合并肝損傷逐漸引起相關人士關注，大量研究表明T2DM會增加肝臟發生纖維化并進一步發展為肝硬化或肝癌的風險，其成為了糖尿病死亡率升高的一個重要因素［2］。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 36只SPF級Wistar雄性大鼠，體質量（105±5）g。由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012—0002。

1.2 實驗藥物和試劑 石斛合劑序貫方（石斛、黃芪、五味子、丹參、川牛膝、生地黃、地龍等）購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院；鹽酸二甲雙胍片（山東明仁福瑞達制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；玉米油、CCl4（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 尼康生物顯微鏡（日本尼康公司，55I）；低溫離心機（美國 Thermo 公司，Multifuge X3R）；分析天平（奧豪斯儀器有限公司，CP214）。

2 實驗方法

2.1 石斛合劑序貫方湯劑的制備 石斛合劑序貫方（1方、2方）以常規水煎2次后合并、過濾。采用旋轉濃縮，配制成石斛合劑1方含生藥量1.7 g／mL、石斛合劑 2 方 1 g／mL。

2.2 動物模型的建立 將36只大鼠按體質量隨機抽取 8只作為正常對照組，其他大鼠先予高糖高脂飼料 （含60.7%基礎飼料、15%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、4%膽固醇、0.3%膽酸鹽）飼養42 d后，繼以低劑量STZ（25 mg／kg，檸檬酸緩沖液配制，pH＝4.2～4.6，現配現用）一次性腹腔注射，繼予高脂高糖飼料喂養，于注射第4、5天用微量血糖測定儀測量空腹血糖，篩選出2次連續測量血糖≥11.1 mmol／L的大鼠，即為糖尿病模型大鼠，不滿足者剔除。糖尿病模型成功后再按大鼠體質量0.2 mL／100 g皮下注射40%CCl4，每周2次，共 6周，建立糖尿病合并肝纖維化模型大鼠。

2.3 分組及干預 糖尿病模型大鼠按體質量和血糖進行隨機分層分組，分為模型對照組、二甲雙胍組、石斛合劑組各8只。石斛合劑組為先予石斛合劑 1 方按 17 g／（kg·d）灌胃 6 d，繼予石斛合劑 2 方按 10 g／（kg·d）灌胃 3 d，如此循環；二甲雙胍組予二甲雙胍按 0.1 g／（kg·d）灌胃；正常對照組、模型對照組予等量生理鹽水灌胃。4組均灌胃干預6周。

2.4 觀測指標

2.4.1 血糖 采用尾靜脈采血，檢測4組大鼠灌胃干預前后的血糖。

2.4.2 血清AST、ALT濃度 采用紫外比色法測定4組大鼠灌胃干預前后血清AST、ALT濃度。

2.4.3 肝臟HE染色及Masson染色 采用HE染色及Masson染色觀察4組大鼠干預后肝臟組織形態。取肝臟常規石蠟包埋切片，觀察肝細胞排列及膠原纖維的表達量。

2.4.4 肝纖維化四項 采用ELISA法檢測4組大鼠干預后血清肝纖維化四項（HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ）。

2.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析處理，符合正態分布的計量資料以（）表示，采用單因素方差分析，非正態分布采用秩和檢驗。

3 實驗結果

3.1 4組干預前后血糖濃度比較 見表1。

表1 4組干預前后血糖濃度比較（）mmol／L

表1 4組干預前后血糖濃度比較（）mmol／L

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型對照組比較，2）P＜0.01；與干預前比較，3） P＜0.01。

干預后4.78±0.41 19.80±4.761）7.10±1.852）3）6.56±4.882）3）組 別正常對照組模型對照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8干預前4.76±0.37 21.12±6.571）17.35±7.251）21.68±6.571）

3.2 4組干預后AST、ALT濃度比較 見表2。

表2 4組治療后AST、ALT濃度比較（）mmol／L

表2 4組治療后AST、ALT濃度比較（）mmol／L

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型對照組比較，3） P＜0.01。

ALT 55.26±3.76 165.81±4.501）77.73±6.862）3）91.86±13.242）3）組 別正常對照組模型對照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8 AST 76.30±5.54 283.10±15.501）108.23±5.722）3）102.76±15.502）3）

3.3 肝臟形態學觀察

3.3.1 HE染色 如圖1所示，正常對照組肝細胞排列整齊、結構完整；模型對照組肝細胞排列紊亂，有大量炎性浸潤，且在匯管區可見大量纖維組織；二甲雙胍組和石斛合劑組炎性浸潤減少，纖維組織較模型對照組明顯減少。

3.3.2 Masson染色 如圖2所示，正常對照組中央靜脈區少量膠原纖維沉積；模型對照組匯管區合中央靜脈區有大量膠原纖維沉積；二甲雙胍組與石斛合劑組中央靜脈區雖仍有膠原纖維沉積，但與模型對照組比較明顯減少，且石斛合劑組減少更明顯。

3.4 4組干預后肝纖維四項指標比較 見表3。

圖1 4組大鼠肝臟HE染色圖（×20）

圖2 4組大鼠肝臟Masson染色圖（×20）

表3 4組干預后肝纖維四項指標比較（）ng／mL

表3 4組干預后肝纖維四項指標比較（）ng／mL

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與模型對照組比較，2）P＜0.01。

LN 65.13±6.54 350.51±31.841）79.52±5.942）87.70±8.942）組 別正常對照組模型對照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8 HA 126.73±9.62 367.95±10.741）175.72±3.821）2）183.00±13.181）2）PC-Ⅲ39.94±1.71 243.46±31.671）48.12±2.552）43.44±3.282）C-Ⅳ70.79±3.38 124.83±47.951）84.46±2.982）81.04±11.772）

4 討論

血糖升高是糖尿病的主要特征，在其發病的過程中會產生諸多并發癥，如視網膜、腎臟、心臟、腦及足等發生病變，同時也會產生許多有害因子。糖基化終產物在糖尿病患者體內過度累積，引起肝組織中氧化應激反應和炎癥反應而損傷肝細胞［3］，當肝臟受到炎性損傷時，肝星狀細胞由靜止狀態轉變為激活狀態。肝星狀細胞激活后轉化為肌成纖維細胞是肝纖維化必經途徑，這一觀點得到大多數人的認可，肝星狀細胞被激活，分泌細胞外基質過度沉積，大量合成α-SMA，最后導致肝纖維化。有研究發現，肝臟疾病也是糖尿病發病率較高的一個并發癥，糖尿病性肝病發病率為7.24%，2型糖尿病并發脂肪肝患病率高達55%［4-5］。在糖尿病與肝纖維化關系的廣泛研究中，已有證據顯示糖尿病是肝纖維化及肝硬化發生的一個重要危險因素［6-8］。

糖尿病核心病機是由各種病因引起全身氣機阻滯，釀生痰濕，郁而化熱，灼傷津液，導致陰虛燥熱，繼而引起痰濕熱交結，滋生濁毒加重痰濕熱，最終導致陰陽兩虛，且瘀血、尤其是經脈瘀阻貫穿整個發病始終。石斛合劑序貫方由石斛合劑1方和石斛合劑2方組成。石斛合劑1方由石斛、黃芪、丹參、知母、生地、葛根、五味子、地龍等組成，益氣養陰，活血通絡。石斛中潤胃陰，下滋腎陰，滋而不膩；黃芪托毒又補脾肺之氣，兩藥合用，肺脾腎三臟之氣陰同補，上中下三焦兼顧，共為君藥。知母、生地清熱涼血，滋陰生津潤燥，壯水制火；丹參活血涼血，祛瘀生新；地龍清熱息風，通絡利尿，共為臣藥。葛根升發脾胃之清陽，生津止渴；五味子斂肺滋腎生津，寧心澀精，一散一收，化而能守，佐助君藥滋陰益氣之功效，共為佐使藥。諸藥相須為用，上中下兼顧，甘溫化氣，酸甘養陰，苦寒清熱，潤燥解毒，三消分治兼清瘀血。石斛合劑2方由茵陳、梔子、大黃、柴胡、滑石、甘草等組成，清肝泄濁，清利濕熱。茵陳清利濕熱，清熱解毒；梔子通利三焦，引濕熱自小便而出，二者共為君藥。大黃煬灶減薪，瀉熱逐瘀，祛其西道壅塞；柴胡疏肝解郁，清其東道邪熱，共為臣藥。滑石甘寒淡滲，以佐清利濕熱之力。甘草調和諸藥。全方藥簡力專，使二便通利，前后分消，濕熱得行，痰瘀得化，濁毒得去。

本研究通過高脂高糖聯合腹腔注射STZ及皮下注射CCl4建立糖尿病合并肝纖維化模型。高脂高糖飼喂6周后聯合小劑量STZ（25 mg／kg）建立糖尿病模型，在此過程中，3只大鼠因空腹血糖＜11.1 mmol／L，不符合糖尿病模型篩選標準，舍去，造模成功率為89.29%；糖尿病成模后，再以2 mL／kg CCl4皮下注射，建立糖尿病合并肝纖維化模型，1只大鼠因皮下注射過程中操作不當死亡。經過石斛合劑序貫方治療6周后，大鼠空腹血糖、肝功能（AST、ALT）明顯改善，肝纖維化四項也明顯降低，且石斛合劑組優于二甲雙胍組。病理活檢是診斷肝纖維化金指標，從肝臟組織形態學可知石斛合劑組和二甲雙胍組膠原纖維蛋白沉積明顯較模型對照組減輕，且石斛合劑組減輕更明顯，其具體可能的機制有待進一步研究。

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