青娥方對去卵巢大鼠血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K及骨組織形態結構的影響

王柄棋，羅文娟，孫雨晴，陳 翔，林燕萍

（福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122）

絕經后骨質疏松癥主要是由于絕經后婦女體內雌激素水平下降，骨重建失偶聯，骨吸收大于骨形成所致，屬于高轉換型骨質疏松癥，其中破骨細胞骨吸收增強是其發病的主要機制之一。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotrinse 9，MMP-9）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tatrate-resistant acid phosphatase，TRACP）、組織蛋白酶 K（cathepsink，Cath-K）是骨吸收過程中重要的骨基質降解酶，脫氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD）是骨I型膠原的降解產物。以上3種酶及尿DPD都是骨吸收的特異性生化指標，能客觀、特異、準確反映破骨細胞的功能活性，顯示骨組織代謝中的骨吸收狀況。本研究通過動物實驗觀察補腎傳統良方青娥方對去卵巢大鼠血清中 MMP-9、TRACP5b、Cath-K 含量和尿液 DPD／Cr的影響，結合骨組織形態結構改變，進一步探討青娥方的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 120只3月齡SPF級雌性SD大鼠，體質量（305±15）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002；由福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房飼養，許可證號：SYXK（閩）2014-0001。

1.2 實驗藥物 青娥方藥物組成：杜仲（鹽炒）480 g，補骨脂（鹽炒）240 g，核桃仁（炒）150 g，大蒜 120 g。購自福建省國醫堂，由福建中醫藥大學求真樓中藥平臺加工成浸膏，每克浸膏含生藥5.79 g。骨疏康顆粒購自遼寧康辰藥業有限公司。

1.3 實驗試劑 TRACP、MMP-9、Cath-K、DPD ELISA試劑盒（上海西塘生物技術有限公司）；肌酐檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；乙二胺四乙酸二鈉（上海博亞生物技術公司）。

1.4 實驗儀器 酶標儀（美國Hologic公司，ELx 800）；切片機（德國 LEICA 公司，RM2135）；超低溫－80℃冰箱（日本SANYO公司，MDF-382E）；生物組織自動包埋機（湖北泰維醫療科技有限責任公司，TB-718E）；電動離心機（金壇市恒豐儀器廠，YJ80-2）；光學顯微鏡（日本OLYMPUS光學工業株式會社）。

2 實驗方法

2.1 造模和干預 120只大鼠在動物房適應性飼養1周后，用隨機數字表法按1∶2的比例分為假手術組和卵巢摘除組。卵巢摘除組行雙側卵巢摘除術，將大鼠仰臥位固定，取腹部正中切口，鈍性分離暴露腹腔，找出雙側卵巢，完全結扎并切除，術后肌肉注射青霉素（每次8萬單位／d），連續注射3 d。假手術組也取腹部正中切口但不切除雙側卵巢，其余步驟同卵巢摘除組。術后卵巢摘除組再用隨機數字表法按1∶1∶1的比例分為生理鹽水組、青娥方組和骨疏康組。實驗大鼠均于術后第3天開始藥物干預。給藥劑量根據人和動物間體表面積折算的等效劑量比值表計算，并根據大鼠體質量變化實時調整給藥劑量。青娥方組按3.6 g／（kg·d）的劑量灌服青娥方生藥，骨疏康組按 1.8 g／（kg·d）的劑量灌服骨疏康顆粒，假手術組、生理鹽水組每天予灌服生理鹽水2 mL／只。各組分別于干預4、8、12周時分批處死取材。

2.2 取材 取材前1天，將各組大鼠按1只／籠置于代謝籠中，予禁食不禁水處理，收集24 h尿液，離心取上清液，分裝后儲存于－80℃冰箱；腹主動脈取血，充分靜置，2 000 r／min，離心 20 min，分裝后置于－80℃冰箱凍存；分離大鼠左側脛骨上段，固定后脫鈣。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 血清生化指標及尿DPD含量檢測 從－80℃冰箱中各取出1份分裝好的血清和尿液樣品，室溫下平衡30 min，確定酶標板中的上樣孔數。參照ELISA試劑盒說明書，在波長450 nm處讀取A值，并根據A值繪制標準曲線，計算樣本血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K及尿DPD的含量。

2.3.2 尿肌酐檢測 －80℃冰箱取出1份尿液，用純水按1∶200比例稀釋，參考肌酐生化試劑盒說明書，以波長510 nm檢測各管吸光值，并計算DPD／Cr比值。

2.3.3 骨組織HE染色及骨小梁面積百分比 分離大鼠左脛骨上段，將周圍軟組織剃凈，多聚甲醛固定，10%EDTA／PBS（pH7.4）脫鈣，石蠟包埋切片，HE染色后鏡下觀察脛骨干骺端的形態結構。應用數碼醫學圖像分析系統（Motic Med 6.0），測定骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）。

骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）＝視野測量框內骨小梁的面積（Tb.Ar） ／測量框總面積（T.Ar）×100%

2.4 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理，計量資料符合正態分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結果

卵巢摘除過程中，因腹腔出血等原因死亡的大鼠共7只，其中干預4周假手術組、生理鹽水組、青娥方組、骨疏康組和干預8周生理鹽水組、青娥方組、骨疏康組每組各1只，共取材113只。

3.1 4組不同干預時間血清 MMP-9、TRACP5b、Cath-K變化比較 見圖1～圖3。

3.2 4組不同干預時間尿DPD／Cr比較 見圖4。

3.3 骨組織形態學變化情況 卵巢摘除后，3個時間點假手術組骨小梁形態大致相同，骨小梁分布均勻，排列規則，交織呈網狀。生理鹽水組骨小梁改變明顯，出現不同程度的變細、變形，呈碎片、斷裂現象。青娥方組和骨疏康組骨小梁完整性不及同期假手術組，但骨小梁數目、排列以及結構完整性均優于同期生理鹽水組。骨小梁面積百分比檢測結果與光鏡下所見基本一致。見圖5、圖6。

圖1 4組不同干預時間血清MMP-9含量比較

圖2 4組不同干預時間血清TRACP5b含量比較

圖3 4組不同干預時間血清Cath-K含量比較

圖4 4組不同干預時間尿DPD／Cr含量比較

圖5 4組大鼠干預12周后骨組織HE染色圖（×50）

4 討論

骨骼塑造完成后，隨著年齡的增長，生物力學環境發生改變，骨骼通過不斷的老骨移除和新骨替換來維持骨的正常功能。“活化—吸收—形成”是骨重建過程的特點，在所有骨重建表面，都要經過骨吸收、骨形成及靜止幾個階段［1］。破骨細胞在骨重建中有著啟動作用，其骨吸收功能的發揮首先需要向骨基質遷移、粘附，然后破骨細胞極化，使皺褶緣、封閉區與骨基質表面形成一個密閉的空間，構成骨吸收裝置，在富含H＋及相關降解酶的環境下溶解骨質［2］。骨基質的降解產物由細胞內吞并經跨胞漿轉運空泡，從皺褶緣運送到功能性分泌結構域，進而釋放到細胞外環境，被血液運輸到腎臟，經腎小球濾過隨尿液排出體外。

圖6 用藥后不同時間各組Tb.Ar%比較

MMP-9在破骨細胞中特異性高表達，主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅹ型膠原。研究發現隨著絕經后婦女血清MMP-9水平的升高，骨基質降解，骨密度逐漸降低［3-7］。 Bolton 等［5］認為 MMP-9 在骨吸收過程中發揮著重要的作用，其實驗研究顯示血清中MMP-9濃度與BMD值呈負相關，證實了他的觀點。TRACP5b是TRACP的同工酶，特異性高表達于破骨細胞，也是血中TRACP5b的主要來源［6］，并在一定程度上反映了破骨細胞的功能活性［8-9］。Cath-K在靜止的破骨細胞中主要以不活躍的Cath-K前體形式存在，Cath-K前體是一條未糖基化的多肽單鏈，在酸性環境下可轉換為具有活性的Cath-K［10］。Cath-K在破骨細胞中顯著表達，能降解骨基質中的Ⅰ型膠原蛋白、骨橋接素和骨連接素，是骨吸收過程中的一個關鍵酶［11-14］。本實驗結果顯示卵巢切除后，3個時間點的生理鹽水組血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量均高于同期假手術組（P＜0.01，P＜0.05），表明卵巢切除后，隨著雌激素水平的下降，血清中骨基質降解酶的含量逐漸升高，骨吸收增強。干預后青娥方組血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量均低于同期生理鹽水組（P＜0.01，P＜0.05），說明青娥方能夠降低血清中骨基質降解酶的含量，進而抑制破骨細胞對骨基質的降解。

DPD是骨膠原纖維的代謝產物，僅存于骨和牙的Ⅰ型膠原纖維中，而后者含量甚微，故尿液中DPD幾乎來源于骨骼，能準確反應骨膠原纖維的分解代謝［15-16］。本實驗結果發現生理鹽水組尿DPD／Cr比值均高于同期假手術組（P＜0.01，P＜0.05），提示卵巢切除后，破骨細胞對骨Ⅰ型膠原的降解作用加強；而青娥方組尿DPD／Cr比值均低于同期生理鹽水組（P＜0.01，P＜0.05），表明青娥方能夠降低破骨細胞的功能活性，抑制其對骨Ⅰ型膠原的降解。同時，骨組織形態結果顯示生理鹽水組骨小梁數目、排列以及結構完整性明顯不及同期假手術組，Tb.Ar%在8、12周均明顯低于同期假手術組（P＜0.01，P＜0.05），提示卵巢切除后，骨吸收增強，骨組織形態遭到破壞；青娥方組骨小梁數目、排列以及結構完整性均優于同期生理鹽水組，Tb.Ar%在8、12周均明顯高于同期生理鹽水組（P＜0.05），進一步說明青娥方能有效地抑制破骨細胞骨吸收功能，減少對骨基質的吸收破壞，發揮護骨的作用。

綜上所述，中藥青娥方可以通過降低血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量，來抑制破骨細胞的功能活性，減少對骨基質的吸收破壞，最終發揮護骨強骨之功。

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