電針后血清對脂多糖誘導的軟骨細胞IL-1β、IL-6表達的影響

陳后煌 ，李西海，李 俐 ，吳追樂，鄭春松 ，徐 欣，洪秀娥 ，吳明霞

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是以軟骨退變、軟骨下骨重建失衡以及骨贅形成為主要特征的慢性骨關節疾病，病情反復，纏綿難愈［1-2］。作為軟骨中唯一的細胞類型，軟骨細胞對維持軟骨的完整性及軟骨的負重功能具有重要作用，軟骨細胞功能改變是引起OA的重要因素。軟骨退變的發病機制尚未完全闡明，但已有研究表明：炎癥因子對骨關節炎軟骨退變進程發揮重要調控作用［3-4］。電針具有舒筋通絡、消腫止痛、補腎益精等作用，其特點為多層面、多途徑、多靶點治療，經過中樞的整合可有效調控機體的免疫應答以及細胞的增殖、分化及凋亡，從而減輕患者的臨床癥狀［5-7］。電針能夠有效改善關節軟骨的炎性癥狀［8］，但其具體機制不甚明了。為探討電針的作用機制，本實驗采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導建立SD大鼠體外軟骨細胞炎癥模型，觀察電針后血清對軟骨細胞炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 華佗牌SD-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；華佗牌一次性不銹毫針，規格：15 mm×0.25 mm（蘇州醫療用品廠有限公司）；IX70倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；LX-800酶標儀（美國BIO-TEK公司）。

1.2 實驗動物 2月齡和4周齡清潔級雄性SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［合格證號：SCXK（滬）2012－0002］。 處理實驗動物依據《關于善待實驗動物的指導性意見》［9］。

1.3 實驗藥物 LPS購自美國sigma公司，用PBS緩沖液溶解，配置成10 μg／mL母液，4℃保存備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 電針后血清的制備 2月齡雄性SD大鼠40 只，隨機分為空白組（n＝10）和造模組（n＝30）。造模組采用改良 Hulth造模法復制膝骨關節炎模型，模型成功的判定標準參考文獻［10］，術后4周，將造模成功的造模組大鼠隨機分為對照組、實驗1組和實驗2組各10只。

實驗組大鼠取雙側膝關節內、外膝眼，采用15 mm×0.25 mm毫針垂直刺入4 mm，調整電子針療儀脈沖頻率2 Hz，輸出脈沖強度2 mA，每周治療5 d，休息2 d，共治療12周。實驗1組每天電針治療15 min，實驗2組每天電針治療30 min，空白組和對照組正常飼養。治療時間按人和動物藥物等效劑量換算：給藥劑量＝臨床常用量×動物等效面積系數，確定電針干預時間為15 min等效于臨床30 min 的治療時間［11－12］。 療程結束后，水合氯醛麻醉，腹主動脈采集血液，制備實驗用血清。

1.4.2 軟骨細胞的分離、培養 4周齡SD大鼠10只脫頸處死，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下分離雙膝關節，切取關節表面軟骨，修剪去除肌肉、骨膜和軟骨下骨，以不滲血為度；切取軟骨，置于無菌培養皿，用PBS緩沖液沖洗關節軟骨3次，沖洗后加入2.5 g／L胰蛋白酶，37℃培養箱消化20 min，終止消化；置入盛有0.2%Ⅱ型膠原酶的培養皿，放于37℃培養箱中，每45 min取上清，用200目濾網過濾，收集濾液，1000 r／min離心 5 min，收集軟骨細胞，并換消化液繼續進行消化，重復4次。用DMEM完全培養液（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL、鏈霉素 100 μg／mL）重懸軟骨細胞，調整軟骨細胞懸液濃度為（2～3）×105／mL，接種于培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，48 h后首次換液，每2 d更換培養液1次，倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞長滿至80%后傳代培養，此為原代軟骨細胞，待細胞長滿至培養瓶底90%左右時，可再次傳代培養［13］。

1.4.3 軟骨細胞分組和干預 第2代軟骨細胞以1×105／mL密度接種于6孔板內，培養24 h后棄培養基，PBS清洗，將細胞分為正常組、模型組、電針15 min組和電針30 min組。正常組加入含10%空白組血清的培養液；模型組加入含10%空白組血清、10 ng／mL LPS的培養液；電針15 min組加入含實驗1組血清、10 ng／mL LPS的培養液；電針30 min組加入含實驗2組血清，10 ng／mL LPS的培養液。干預8 h后，ELISA法檢測各組細胞培養液中IL-1β、IL-6 的含量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件處理數據。計量資料屬正態分布以（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。

2 實驗結果

2.1 軟骨細胞形態學觀察 原代軟骨細胞早期多呈多角形或三角形，1～3個核仁，大小和致密程度不等；培養3 d后可見軟骨細胞逐漸增大，胞核與核仁也逐漸清晰（圖1A）。第1代軟骨細胞，以圓形或橢圓形為主，培養3 d可見細胞融合，出現成簇生長現象（圖1B）。第2代軟骨細胞增殖速度較快，形態結構一致，呈星形、多邊形，胞漿豐富，胞核清晰，可見1～2個核仁，逐漸融合為單層，呈不規則“鋪路石”樣（圖1C）。第3代軟骨細胞增殖速度相對減慢，多出現脂肪粒樣“老化”現象（圖1D）。

圖1 軟骨細胞形態圖（×200）

2.2 軟骨細胞的Ⅱ型膠原免疫組化鑒定 Ⅱ型膠原免疫組化染色可見陽性細胞的胞漿呈棕黃色（圖2A），未見棕黃色為陰性細胞（圖2B）。

2.3 4組軟骨細胞干預后IL-1β、IL-6表達變化比較 見圖3。

3 討論

3.1 軟骨細胞的培養鑒定 軟骨退變是骨關節炎的主要病理特征，表現為軟骨細胞、軟骨基質以及軟骨下骨降解與合成偶聯正常失衡。軟骨細胞為關節軟骨中唯一的細胞類型，利用機械和化學分離方法，通過原代培養和傳代培養，可分離培養出純度較高的軟骨細胞［14］。軟骨細胞無特異性標志物，通過對其分泌的主要基質成分Ⅱ型膠原免疫組化染色，結合取材部位和培養觀察來鑒定，Ⅱ型膠原免疫組化顯示軟骨細胞胞質呈棕黃色，胞核不顯色［15-17］。

圖2 軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組化鑒定圖（×200）

圖3 4組軟骨細胞干預后IL-1β、IL－6表達變化圖

3.2 體外誘導軟骨細胞炎癥模型 炎癥介質是介導骨關節炎軟骨退變的關鍵因素，在骨關節炎的病理進程中發揮重要的調控作用。細胞因子是一組多肽類細胞調節物質的總稱，其中IL-1β、IL-6是骨關節炎病理過程中促進關節軟骨破壞和軟骨基質降解最主要的細胞因子。本實驗采用LPS刺激體外大鼠軟骨細胞模擬建立骨關節炎軟骨細胞的炎癥模型，在細胞水平研究骨關節炎的相關機制［18］。

3.3 電針后血清對軟骨細胞炎癥的影響 實驗結果顯示，電針后血清能夠降低LPS誘導的軟骨細胞上清液炎癥因子IL-1β、IL-6的表達，提示電針治療骨關節炎的可能分子機制是通過降低軟骨細胞中異常升高的IL-1β和IL-6水平，減少機體炎癥因子的釋放，減輕炎癥刺激，從而抑制軟骨基質的降解，延緩軟骨的退變和骨關節炎的進一步發展。

3.4 本研究的局限性及展望 本研究的不足之處在于檢測的炎癥指標只涉及最常見的炎癥因子IL-1β和IL-6，其他相關炎癥指標如TNF-α、MMPs等也有可能發生改變，并且對軟骨細胞的形態、活性及功能產生影響；通過體內實驗研究，如HE染色、免疫組化染色、電鏡觀察等，可以更為直觀地觀察電針對關節軟骨炎癥的影響；從相關信號通路及Micro-RNAs角度進一步探討電針對軟骨細胞炎癥的影響，這都將是未來的研究方向。

［1］ 李西海，梁文娜，葉蕻芝，等.獨活寄生湯調控風寒濕痹型骨關節炎軟骨下骨重建失衡的作用機制探討［J］.風濕病與關節炎，2014，3（8）：62-64，80.

［2］ 陳后煌，邵翔，馬玉環，等.骨關節炎骨贅形成的機制探討［J］.風濕病與關節炎，2016，5（5）：36-38.

［3］ KROMAN S L，ROOS E M，BENNELL K L，et al.Measurement properties of performance-based outcome measures to assess physical function in young and middle-aged people known to be at high risk of hip and／or knee osteoarthritis：a systematic review ［J］.Osteoarthritis Cartilage，2014，22（1）：26-39.

［4］ LI C，CAI H，MENG Q，et al.IL-1β mediating high mobility group box protein-1 expression in condylar chondrocyte during temporomandibular joint inflammation ［J］.J Oral Pathol Med，2016，45（7）：539-545.

［5］ WU M X，LI X H，LIN M N，et al.Clinical study on the treatment of knee osteoarthritis of Shen-Sui insufficiency syndrome type by electroacupuncture ［J］.Chin J Integr Med，2010，16（4）：291-297.

［6］ PLASTER R，VIEIRA W B，ALENCAR F A，et al.Immediate effects of electroacupuncture and manual acupuncture on pain，mobility and muscle strength in patients with knee osteoarthritis：a randomised controlled trial ［J］.Acupunct Med，2014，32（3）：236-241.

［7］ 吳廣文，鄭春松，李西海，等.電針對實驗性膝骨關節炎大鼠軟骨細胞凋亡及軟骨基質的影響［J］.康復學報，2017，27（5）：22-28.

［8］ LI J，LI J，CHEN R，et al.Targeting NF-κB and TNF-α activation by electroacupuncture to suppress collagen-induced rheumatoid arthritis in model rats ［J］.Altern Ther Health Med，2015，21（4）：26-34.

［9］ 中華人民共和國科學技術部.關于發布《關于善待實驗動物的指導性意見》的通知［J］.畜牧獸醫科技信息，2007（4）：35-36.

［10］劉獻祥，李西海，周江濤.改良Hulth造模法復制膝骨性關節炎的實驗研究［J］.中國中西醫結合雜志，2005，25（12）：1104-1108.

［11］吳明霞，李西海，李俐，等.電針后血清對TNF-α誘導凋亡軟骨細胞 MAPK 信號通路的影響［J］.福建中醫藥，2011，42（6）：43-45.

［12］吳明霞，李西海，吳廣文，等.電針后血清對腫瘤壞死因子α誘導軟骨細胞凋亡的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（46）：8551-8555.

［13］葉錦霞，吳廣文，李西海，等.透骨消痛膠囊對凋亡軟骨細胞Rac1和Cdc42表達的影響［J］.中國組織工程研究，2014，18（42）：6747-6751.

［14］ FRONDOZA C G，HEINECKE L F，GRZANNA M W，et al.Modulation of cytokine-induced prostaglandin E2production in cultures of articular chondrocytes obtained from carpal joints of camels （Camelus dromedarius） ［J］.Am J Vet Res，2011，72（1）：51-58.

［15］ LIN P，WENG X，LIU F，et al.Bushen Zhuangjin decoction inhibits TM-induced chondrocyte apoptosis mediated by endoplasmic reticulum stress ［J］.Int J Mol Med，2015，36（6）：1519-1528.

［16］ LIU F，LIU G，LIANG W，et al.Duhuo Jisheng decoction treatment inhibits the sodium nitroprussiate-induced apoptosis of chondrocytes through the mitochondrial-dependent signaling pathway ［J］.Int J Mol Med，2014，34（6）：1573-1580.

［17］ WENG X，LIN P，LIU F，et al.Achyranthes bidentata polysaccharides activate the Wnt／β-catenin signaling pathway to promote chondrocyte proliferation ［J］.Int J Mol Med，2014，34（4）：1045-1050.

［18］ WANG Y，ZHANG J J，YANG W R，et al.Lipopolysaccharideinduced expression of FAS ligand in cultured immature boar sertoli cells through the regulation of pro-inflammatory cytokines and miR-187 ［J］.Mol Reprod Dev，2015，82（11）：880-891.