USP6基因重排檢測在動脈瘤樣骨囊腫病理診斷中應用的初步探討*

楊邵敏 由江峰 齊雙雙 王 華

(北京大學基礎醫學院病理學系，北京 100191)

動脈瘤樣骨囊腫(aneurysmal bone cyst，ABC)是一種具有局部侵襲性的良性骨腫瘤，受累骨發生膨脹性破壞。經典的ABC病變由含有血液的多房囊腔構成。多種良性和惡性骨病變可以發生出血和(或)囊性變，類似ABC結構，稱為繼發性ABC[1]。原發性和繼發性ABC從臨床和影像學上經常難以鑒別。病理檢查在送檢樣本較少或者病變表現不典型時經常難以確診。目前，原發性和繼發性ABC的病理診斷主要依靠常規H&E染色切片的形態觀察，依賴于病理醫生的經驗和主觀判斷，沒有客觀的免疫組化和分子診斷指標。

Oliveira等[2]報道原發性ABC病變中存在泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease，USP6)基因的斷裂和易位，而繼發性ABC中未發現此改變。雖然USP6基因的斷裂重排在原發性ABC發病機制中的作用尚不太明了，但其可以作為原發性和繼發性ABC病理診斷的客觀輔助標準[2]。

對于病理科常規的福爾馬林固定石蠟包埋組織，染色體熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)檢測是較為實用的染色體重排檢查方法，比核型分析和逆轉錄PCR(RT-PCR)方法更適用于臨床。FISH法可以原位觀察組織，少量樣本即可檢測，樣本制備處理相對簡單，是病理科常用的分子檢測方法。本研究收集2015年1月～2017年8月北京大學第三醫院及外院申請病理會診的可疑ABC 20例，探討FISH法檢測USP6基因斷裂重排的應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

本組20例，因常規病理H&E染色難以鑒別原發性或繼發性ABC，申請做USP6基因FISH檢測。男9例，女11例。年齡7～46歲，平均17.7歲。脊柱病變16例，橈骨病變2例(其中1例位于橈骨表面)，肋骨病變2例。MRI檢查均顯示為溶骨性膨脹性骨破壞，病變邊界清楚，呈多房囊性或囊實性，囊內可見液-液平面，提示存在動脈瘤樣骨囊腫。9例行穿刺活檢，11例為手術刮除或切除標本。具體見表1。

表1 20例ABC的資料和診斷

注：C：頸椎；T：胸椎；L：腰椎；ABC：動脈瘤樣骨囊腫

1.2 標本處理和病理診斷標準

送檢組織常規福爾馬林固定、石蠟包埋。含有質硬骨組織的樣本經10%甲酸脫鈣液處理至軟化可以切片。H&E染色切片由2名以上資深骨關節專業病理醫師閱片。

原發性ABC的病理診斷按照2013年WHO軟組織和骨腫瘤分類[1]，有如下特點：病變含有囊壁樣結構，囊壁主要由增生的梭形細胞構成，細胞密度中等，異型性不明顯，分裂象可多可少，但無病理性核分裂象。囊壁分布多核巨細胞，部分病例可見編織骨(圖1～3)。當病變中實性結構多見，僅局灶有不明顯囊腔形成，詳細檢查未見其他原發病變時，提示為實性ABC(圖4、5)。

1.3 FISH染色方法及結果判讀

ZytoLight SPEC USP6雙色分離探針試劑盒購自CytoVision公司(ZytoVision GmbH，德國)。探針位于染色體17p13.2，基因近端(近著絲粒)探針標記紅色熒光，基因遠端(近端粒)探針標記綠色熒光。

FISH染色按標準步驟進行，簡要如下：切片厚度為4 μm，65 ℃烤片過夜，依次脫蠟、水化，經蛋白酶K(100 mg/L)消化20分鐘，滴加探針，雜交儀中37 ℃孵育過夜。4’,6-聯脒-2’-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2’-phenylindole，DAPI)復染后熒光顯微鏡下觀察。

FISH結果由2位病理醫師單獨判讀：至少計數100個不重疊的細胞核，紅色信號和綠色信號距離>2個信號點直徑視為陽性細胞。參照文獻[2]，陽性細胞比例>7%視為分離重排陽性。

病理診斷與FISH結果判讀分別由病理診斷醫師和分子檢測醫師完成。

2 結果

20例結果見表1。

經FISH檢測，18例獲得可判讀的良好熒光信號；2例檢測不成功，熒光信號無法判讀，均為經酸脫鈣后的手術標本。9例穿刺小標本均獲得質優的可判讀熒光信號。

9例USP6基因斷裂重排陽性：結合常規病理組織學特點，確診7例普通型ABC和2例實性ABC，其中1例位于橈骨表面，支持骨表面原發性ABC。陽性病例均為17號染色體二倍體，陽性細胞中可見1個黃色信號(紅色和綠色信號重疊)、1個紅色信號和1個綠色信號(圖6)。8例陽性細胞比例為50%～70%，1例陽性細胞比例為10%。

9例USP6基因斷裂重排陰性，只能觀察到黃色信號，紅色和綠色信號分離的陽性細胞計數<1%；經術后標本全面檢查，4例在病變某些區域發現有骨巨細胞瘤(2例)、骨母細胞瘤(1例)、纖維結構不良(1例)成分，從而確診為繼發性ABC(圖7～9)。另5例切除標本全面檢查仍未見其他原發病變，符合原發性ABC的病理組織學特點。

本研究共成功檢測14例原發性ABC和4例繼發性ABC。FISH法檢測USP6基因斷裂重排診斷原發性ABC的敏感性為64%(9/14)，特異性為100%(4/4)，準確率為72%(13/18)。見表2。

圖1 原發性ABC，病變一側為囊壁結構(H&E染色 ×10) 圖2 原發性ABC，囊壁由梭形細胞、多核巨細胞和炎癥細胞構成(H&E染色 ×40) 圖3 原發性ABC，囊壁編織骨形成(H&E染色 ×20)圖4 原發性ABC，實性ABC中囊腔結構不明顯，僅局灶可見出血(H&E染色 ×4) 圖5 原發性ABC，實性ABC由梭形細胞、多核巨細胞和炎癥細胞構成(H&E染色 ×40) 圖6 原發性ABC，USP6基因分離探針FISH檢測可見紅綠分離的陽性信號 圖7 骨巨細胞瘤繼發ABC，可見含血的囊腔(H&E染色 ×20) 圖8 骨巨細胞瘤繼發ABC，病變其他區域可見骨巨細胞瘤成分(H&E染色，×20) 圖9骨巨細胞瘤繼發ABC，FISH檢測顯示紅綠信號重疊呈黃色，未見分離

表2 FISH法檢測USP6基因斷裂重排診斷原發性ABC的價值

3 討論

ABC是一種良性骨腫瘤，具有局部侵襲性，以往曾被認為是反應性增生。Oliveira等[2]報道原發性ABC存在染色體17q13上USP6基因平衡易位，提示病變為腫瘤性。目前發現的易位伙伴基因包括CDH11、ZNF9、COL1A1、TRAP150和CMD。USP6即泛素特異性蛋白酶[3,4]，染色體重排使USP6基因的編碼區與上述伙伴基因高度活躍的啟動子區結合，上調USP6基因轉錄，使Jak1去泛素化，活化Jak1-STAT3信號通路[5]，可能與骨母細胞成熟阻滯和基質金屬蛋白酶產生異常有關[6,7]，參與疾病發生發展。未發現繼發性ABC中存在USP6基因的易位重排[2]。

原發性ABC可發生于任何骨，最常見于長骨干骺端，特別是脛骨、腓骨、肱骨，其次是椎體后側附件。本組脊柱病變多，與北京大學第三醫院骨科以收治脊柱患者為主有關。ABC通常發生在髓腔，少數發生在骨表面(骨表面ABC)[8]。大約1/3 ABC為繼發性。本組以及Oliveira等[2]的報道均顯示，USP6基因分離重排對原發性ABC的特異性為100%，敏感性接近70%。USP6基因的FISH檢測在分子水平上為甄別原發性ABC提供幫助。本組USP6重排陰性的9例中，4例術后全面檢查在病變局部發現骨巨細胞瘤、骨母細胞瘤、纖維結構不良病變，5例USP6基因易位重排陰性的原發性ABC可能與不同于USP6的其他基因有關，其發病機制有待進一步研究。另外，原發性ABC特別注意需要與血管擴張型骨肉瘤鑒別，兩者均好發于20歲以下年輕人，組織學表現有某些相似性，USP6基因重排檢測從分子水平為兩者鑒別提供幫助。本組1例(例2)發生在橈骨表面，臨床考慮不能除外骨肉瘤，USP6基因易位檢測支持骨表面的原發性ABC診斷，避免過度治療。也有少數發生在軟組織的原發性ABC[8]，以及個別轉移的病例報道[9]。這些少見部位和臨床表現不典型病例是否為真正的原發性ABC，需要遺傳學證據的支持。

原發性ABC的治療有手術和非手術方式，如栓塞治療、狄諾塞麥(denosumab)藥物治療等[10,11]。對于脊柱等手術難度較大的病變部位，以及年齡較小的患者，損傷較小的治療方式更為適用。常在治療前進行穿刺活檢排除骨巨細胞瘤、骨肉瘤等繼發性ABC。但因穿刺獲得的組織量較少，給病理診斷帶來極大挑戰。較小穿刺標本組織固定一般較為及時充分，不需長時間經酸脫鈣，FISH檢測更為穩定。本組9例穿刺樣本全部獲得滿意的熒光信號，其中4例陽性，從而使較少的送檢樣本即得以確診，避免過大手術。經酸脫鈣的手術標本可能因組織處理而影響探針雜交，本組11例手術標本中2例檢測不成功。

實性ABC是一種較為少見的病變，呈囊實性，缺乏經典ABC的海綿樣腔隙，以較多間隔較厚的實性區為主，臨床和病理表現不典型[12]。本組14例原發性ABC中2例經FISH檢測確認為實性ABC，與本組申請基因檢測的病例以疑難病例為主有關。實性ABC的組織學特點是：梭形細胞彌漫性增生，細胞核無多形性，含有散在、簇狀分布的破骨樣巨細胞，鈣化的纖維黏液樣間質，有骨母細胞分化和骨樣組織產生。這些組織學表現與典型原發性ABC的囊壁結構相同，但缺乏囊腔結構，單純根據組織學表現經常難以確診[12～14]。

巨細胞修復性肉芽腫發生在頜骨和手足小骨，組織學表現與實性ABC類似。研究顯示手足小骨的巨細胞修復性肉芽腫也存在USP6基因易位，提示病變本質是ABC，而頜骨類似病變均為陰性，因此有學者建議將手足小骨的巨細胞修復性肉芽腫診斷為實性ABC[15]，而頜骨的巨細胞修復性肉芽腫是不同于ABC的病變。

USP6基因重排也見于大約90%的結節性筋膜炎[16]，這是一種間葉組織病變，含有大量增生的纖維母細胞，病變通常細胞豐富，是一種假肉瘤性肌纖維母細胞增生，可自發消退，以往被認為是對創傷的反應，目前認為是一種軟組織腫瘤。USP6基因重排同樣見于結節性筋膜炎的類似病變——骨化性肌炎[17]，有學者認為最好把此兩種病變統一歸為軟組織的ABC，此類病變中USP6基因最常見的易位伙伴是MYH9基因，位于22q12.3，該易位伙伴并未發現于骨的ABC。此類病變也可應用USP6基因FISH進行檢測。

綜上，利用FISH法檢測USP6基因重排陽性是一種實用有效的原發性ABC的輔助診斷方法，特別有助于少量樣本、臨床病理學表現不典型原發性ABC的診斷。但由于本病少見，本研究樣本量較少，確切結果尚待積累更多病例。

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