煙草野火病菌特異性檢測引物篩選及應用

陳瑞朋，盧 凱，張 敏，劉元德，宗 浩，牛紀軍，劉文濤，徐后娟*

煙草野火病（Tobacco Wildfire）是由丁香假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas syringaepv.Tabaci）危害引起的一種煙草中后期葉部病害，在世界范圍內廣泛分布。該病害在我國各主產煙區均有報道，近幾年在云南、山東等主要產煙區的發生危害普遍且呈上升趨勢，氣候適宜時極易造成大面積流行，從而影響到煙草的優質高效生產[1-2]。目前對于煙草野火病的檢測方法一般是基本對發病癥狀的觀察，此類方法必須是在發病之后，無法對病害進行提前的預報[3-6]，且田間病害癥狀發病初期和其他幾種葉部病害相似，生產上容易導致誤診。利用分子生物學病害診斷法具有準確、靈敏、快速等優點，已經廣泛應用于植物病害的診斷[7-9]。本研究利用Mauve軟件，對不同的假單胞菌屬以及丁香假單胞菌不同致病變種的全基因組進行比對，找到了丁香假單胞菌煙草致病變種的特異性區段，并據此進行了丁香假單胞菌煙草致病變種的檢測引物的篩選和應用研究[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：煙草野火病標準菌株由牡丹江煙草研究所提供。其他煙草野火病菌分別采集于山東省諸城市、高密市、臨朐縣、沂水縣、蒙陰縣、沂南縣、日照嵐山以及貴州省、湖北省、福建省、云南省。供試對照菌株均為實驗室保存，分別為蟲媒假單胞桿菌（P. entomophila）、類黃色假單胞桿菌（P.parafulva）、惡臭假單胞桿菌（P. putida）、嗜鹽假單胞桿菌（P. psychrotolerans）、熒光假單胞桿菌（P.fluorescens）、青枯假單胞桿菌（P. solanacearum）、巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）、枯草芽胞桿菌（B. subtilis）、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、鏈格孢菌（Alteraria alternata）、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、沙福芽孢桿菌（B. safensis）、嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）、歐文氏桿菌（Erwinia carotovora）；DNA聚合酶等購置于諾唯贊生物科技有限公司，引物由上海生工生物科技有限公司合成，PCR測序由青島擎科梓熙生物技術有限公司完成，DL1000 maker購置于大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草野火病菌引物設計 從NCBI基因組數據庫中下載全基因組數據，包括假單胞菌屬 25個不同菌種以及127個丁香假單胞菌屬不同致病變種，利用軟件Mauve 2.3.1進行全基因組比對，獲得特異性區段之后，利用Primer 6.0軟件進行引物設計。

1.2.2 細菌DNA的提取 DNA模板的簡易制備參照赫然等的煮沸法[11]。基因組 DNA的提取使用CTAB 法[12]。

1.2.3 PCR鑒定引物特異性 首先將設計的13對引物與煙草野火病標準菌株進行PCR擴增，篩選出能夠產生單一的目的大小條帶的引物，之后利用篩選出來的引物與對照菌株進行PCR擴增，觀察其能否與其他病原菌產生陽性反應。PCR擴增條件為：94 ℃預變性10 min； 94 ℃變性30 s，5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃再延伸10 min；PCR加樣體系如表1。

1.2.4 煙草感病葉片中野火病模板的制備 取大田中疑似感病的煙草葉片 10片，進行表面消毒，將病斑以及病斑周圍1 cm以內的葉片剪下，以病斑圓心為中心點，每3 mm將葉片切條，放于100 μL超純水中浸泡兩天兩夜。取50 μL浸泡液于金屬浴100 ℃加熱 10 min作為模板備用。感病葉片檢測PCR加樣體系如表2。

表1 PCR加樣體系Table 1 PCR system

表2 PCR加樣體系Table 2 PCR system

2 結 果

2.1 引物設計

利用軟件Mauve 2.3.1進行全基因組比對，共找到P. syringae pv.tabaciATCC 11528的特異性序列段51個，進一步利用Primer Premier 6.0對這些特異性序列段進行引物的設計，共設計引物13對，如表3所示。

2.2 引物篩選

將設計好的13對引物分別進行PCR反應，模板為煙草野火病標準菌株，結果如圖1所示。其中引物5455、48016、40429、33239以及27344均能擴增出目的大小條帶，測序驗證為煙草野火病菌，其余8對引物擴增條帶不理想，雜帶過多。

表3 煙草野火病菌引物Table 3 Primers of Pseudomonas syringae pv. Tabaci

圖1 煙草野火病菌引物篩選結果Fig. 1 Amplification results of P. syringae pv. Tabaci with different primers

2.3 引物的特異性篩選

將篩選出的5對引物分別與供試15種對照菌株進行普通PCR擴增，檢測初篩的5對引物的特異性。結果如圖2所示，引物5455、48016、33239、27344對于部分其他菌株能夠擴增出條帶，引物40429對于15種相近其他病菌株均未擴增出條帶。因此，確定引物40429為最佳煙草野火病菌的最佳引物。

圖2 不同引物對照菌種的PCR擴增結果Fig. 2 Amplification results of control bacteria with different primers

2.4 引物的特異性檢驗

用實驗室保存的來自 11個不同地區和標準的煙草野火病病菌，對引物 40429進行特異性檢測。如圖3所示：引物40429均能夠對于來自不同地區的煙草野火病擴增出單一的目的條帶，條帶大小為203 bp，測序之后在NCBI進行Blast比對顯示為煙草野火病菌，說明引物40429能夠對煙草野火病菌進行良好的特異性擴增。

圖3 引物40 429對不同地區煙草野火病鑒定結果電泳圖Fig. 3 Amplification results of P. syringae pv. tabaci from different regions with primer pair 40 429

2.5 煙草野火病病菌最低檢測濃度的測定

用設計的最優引物40 429對煙草野火病菌進行PCR擴增，模板取1 μL。將煙草野火病菌分別稀釋為 1010、109、108、107、106、105、104、103、102、10 cfu/mL 10個數量級梯度濃度。電泳結果如圖4所示：當模板濃度降低到106cfu/mL時，PCR擴增產物開始明顯降低，當模板菌液濃度為104cfu/mL時，PCR擴增產物較少，但是仍然能夠檢測到，因此，最低檢測濃度為104cfu/mL。

圖4 不同模板濃度PCR電泳圖Fig. 4 Amplification results of different template concentrations

2.6 煙草感病葉片中野火病分子檢測

取上述制備的模板進行PCR擴增，PCR結果如圖5所示，當距離分別為3 mm和6 mm時候，進行PCR反應能夠產生特異性擴增，當距離大于6 mm時，由于模板濃度過低未產生反應。說明該引物能夠對大田中感病的煙草葉片能夠進行較好的檢測。

圖5 煙草感病葉片PCR鑒定電泳圖Fig. 5 Amplification results with infected tobacco leaves

3 討 論

煙草野火病嚴重危害煙草葉片的完整度以及烤后煙葉的外觀質量，給煙草農業生產造成巨大的經濟損失。在實驗室使用煙草野火病菌作為PCR反應模板時，本試驗最終獲得的分子檢測引物能夠對煙草野火病進行精確的檢測，PCR反應特異性強，并且對于相近的其他雜菌不產生反應。與前人設計的引物相比較，本試驗設計的引物條帶大小較小，擴增產物僅為203 bp，并且對于反應體系的要求比較低，在進行PCR擴增時候能夠大大的縮短分子檢測所用時長，該引物設計時獲得的特異性區段，能為其他試驗的引物設計提供思路。同時在對煙草表面的優勢菌群進行同步檢測時，未見擴增出任何的條帶，所以本試驗獲得的引物對于煙草野火病能夠較好地檢測。

在大田實際應用中，試驗獲得的引物能夠對煙草葉片中的煙草野火病菌進行直接檢測，但是檢測的條件比較嚴格，如果直接使用煙草病葉浸出液作為PCR擴增模板，只有距離病斑部位很近時候才會產生目的條帶，這是由于煙草葉片病斑部位的病菌含量較低，本試驗檢測到的病菌最低檢測濃度為104cfu/mL，只有當病菌的濃度達到這個臨界值時，PCR才能夠進行較好的擴增并產生明顯的條帶。葉片中的病菌的數量由于達不到檢測的最低限度，需要較多的葉片累加進行模板病菌的獲取才能夠進行擴增。

4 結 論

本試驗利用Mauve 2.3.1和Primer Premier 6.0獲得了多對煙草野火病菌引物，通過PCR篩選驗證得到1對煙草野火病菌特異性引物。利用煙草野火病菌和感病煙葉浸出液為模板進行PCR擴增，得到單一目的條帶，證明該引物對于煙草野火病菌能夠進行特異性擴增，對煙草野火病菌進行良好的檢測。

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