煙草黑脛病拮抗真菌的篩選及活性評價

彭 閣，姜乾坤，譚 軍，向必坤*，王 瑞，郭 利，趙秀云

隨著煙草種植面積擴大、氣候變化和種植模式改變，威脅煙草安全生產的病蟲害日益嚴重[1]，其中煙草黑脛病是具有毀滅性的土傳真菌病害，給煙草種植業帶來巨大損失。目前防治該病害的主要方式為化學防治，是快速遏制病情蔓延的有效手段。然而化學農藥不科學的投入和施用使得田間環境污染、生態平衡破壞以及病原菌對化學藥劑產生抗藥性的風險非常高[2]。因此，綠色可持續的煙草黑脛病防治新技術研究與應用對于煙草安全生產非常必要。

植物病害的生物防治，利用有益微生物調節農田微生態環境，達到防治病害的目的，是一種無污染、無殘留、環境友好的防治手段，已成為煙草病害生物防治的熱點。木霉作為一種有益真菌分布廣泛，在土壤中易分離且適合人工培養。研究發現木霉作為拮抗菌對植物病原真菌具有良好的防治效果[3]。木霉通過營養和空間競爭、寄生、抗生、促進植物生長、誘導抗性等機制對植物病原菌產生拮抗作用[4]，具有廣泛適用性和綠色無污染等特點，已成功用于農業生產且國外已開發成相關商品制劑[5]。黑曲霉是一種重要的工業微生物，已廣泛被應用于發酵生產檸檬酸、果膠酶、蛋白酶[6]，也被用于生物轉化[7]、廢物利用[8]，具有安全性和穩定性。但將其用于植物病原真菌防治，很少有相關報道。

本研究從煙草根際土壤中篩選分離得到對煙草黑脛病菌有很好抑制效果的木霉、煙曲霉和黑曲霉菌株，對其進行形態學和分子生物學鑒定、纖維素酶和蛋白酶檢測、產孢能力比較以及田間防治效果分析，以期為煙草黑脛病生防制劑開發利用提供菌種資源和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種為黑脛1號菌種，由湖北省煙草研究院李錫宏研究員提供。土樣采集于襄陽市南漳縣薛坪鎮栗林坪村云煙 87健康煙田煙草根際土壤、云煙87煙草黑脛病發病嚴重田中健康煙草根際土壤。拮抗真菌的分離和培養為 PDA培養基，蛋白酶分泌測定為酪蛋白培養基[9]，纖維素酶分泌測定為纖維素剛果紅培養基[10]，葡萄糖標準溶液、磷酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.0）、CMC緩沖液、DNS顯色劑均參考農用微生物菌劑國家標準[11]。

1.2 生防菌分離與篩選

將土樣混勻后，準確稱取10 g土壤樣品，按照Niemann[12]的方法稀釋。分別取10-3，10-4，10-5稀釋液0.1 mL于PDA培養基平板上，涂布均勻，28 ℃培養 5～7 d；挑取菌落形態差異明顯的菌落進行劃線分離純化培養，4 ℃冰箱保存。

將分離的真菌培養物和煙草黑脛病菌分別在PDA培養基上28 ℃培養5～7 d，采用對峙培養法[13]進行篩選。28 ℃培養7 d后觀察抑制作用，計算抑菌率。抑菌率（%）=[(對照直徑-處理直徑)/對照直徑]×100%。

1.3 菌種鑒定

將純化培養后的拮抗真菌在 PDA平板上倒置培養5～7 d后，采用尚博菲[14]使用的小瓊脂塊培養法用番紅染色觀察菌絲和孢子形態特征。真菌基因組DNA提取參考文獻[13]。18S rDNA擴增所用引物和反應條件參考文獻[15]。將18S rDNA擴增產物純化回收后測序，測序結果在GeneBank數據庫進行BLAST比對，選取同源性較高的18S rDNA基因序列作為參比對象，運用 MEGA4.0采用Neighbour-joining法構建系統發育樹。結合形態特征與18S rDNA序列分析對菌株進行鑒定。

1.4 生防菌特性測定

1.4.1 分泌纖維素酶能力測定 將純化后的真菌，用無菌牙簽挑取點接在剛果紅纖維素培養基上，在28 ℃倒置培養3～5 d。培養結束后，向平板中加入1 mg/mL剛果紅染液（以覆蓋整個平板為宜），10～15 min后，倒去剛果紅染液，加入1 mol/L NaCl溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，反復操作3～4次觀察是否有水解圈出現。

1.4.2 分泌蛋白酶能力測定 將純化后的真菌，用無菌牙簽挑取點接在酪蛋白培養基上，28 ℃倒置培養3～5 d觀察是否有水解圈出現。

1.4.3 真菌固態發酵產孢子 按照 1∶1稱取蛭石與玉米粉共10 g，裝于9 cm平皿內121 ℃滅菌20 min，65 ℃烘箱干燥2 d。在PDA平板上培養5～7 d的真菌用無菌水洗滌刮下孢子，用血球計數板在顯微鏡下計數算出洗滌液中孢子濃度，調節孢子濃度為 1.2×107個/mL用于接種，接種量為 10%。營養液為(NH4)2SO40.5%，MgSO40.5%，酵母粉0.6%，含水量為 32.8%。接種完畢后，混勻放置 28 ℃培養。分別在第8、10、12 d取樣于顯微鏡下測定孢子濃度。每種菌3次重復。

1.4.4 固態發酵產物羧甲基纖維素酶（CMC）活性測定 （1）標準曲線繪制，參考農用微生物菌劑標準[11]。（2）酶活性的測定與定義，稱取固態發酵產物10 g，參考農用微生物菌劑標準[11]處理后取上清液測定，每種菌各做3個平行。測定步驟見表1。

纖維素酶活性的計算：根據標準曲線將測得的OD值換算成葡萄糖微克數，按下列公式計算酶活力。

式中：U—樣品的酶活，μg/g；

k—樣品稀釋倍數；m1—樣品葡萄糖含量，μg；

m0—對照中葡萄糖含量，μg；

20—酶與底物反應時間，min。

酶活性定義為：1 mL原樣酶液，1 min產生1 μg葡萄糖定義為1個酶活力單位。

表 1 纖維素酶活性測定Table 1 Determination of cellulase activity

1.5 田間試驗

田間試驗在襄陽市南漳縣薛坪鎮栗林坪村進行。

試驗藥劑：將拮抗真菌經固體發酵10 d后自然干燥用于田間試驗。

處理與藥劑用量：試驗設置4個處理，分別為木霉 ZP2-1、煙曲霉 GZ3、黑曲霉 ZP2-4、霜霉威鹽酸鹽。施用方法：拮抗真菌固體發酵菌粉各200 g，霜霉威鹽酸鹽（有效含量66.5%）80 mL分別加至50 L水中，混勻后每棵煙草灌根200 mL。共施用2次，移栽后15 d、30 d各施用1次。每個處理分為兩行，每行為64棵煙草。

調查、記錄和測定方法：1）調查時間和次數：共調查2次，施藥當天調查1次（病情基數），施藥后隔10 d調查1次。2）調查方法：以株為單位，調查發病分級標準按國家煙草病害調查分級標準GB/T23222—2008進行[16]。3）藥效計算方法：病情指數=[Σ（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×最高級值）]×100，發病率=發病煙株數/調查煙株總數×100%，防治效果=[（施藥前病情指數-施藥后病情指數）/施藥前病情指數]×100%。

2 結 果

2.1 拮抗真菌分離

從健康煙田煙草根際土壤中共分離純化獲得真菌 13株，通過平板對峙篩選得出對煙草黑脛病菌有抑制作用的真菌有3株，編號為ZP2-1、ZP2-3、ZP2-4。從發病嚴重煙田健康煙株根際土壤中共分離純化獲得真菌7株，其中通過平板對峙初篩得出對煙草黑脛病菌有抑制作用的真菌有2株，編號為GZ3、GZ7。圖 1顯示兩種土壤中對煙草黑脛病菌有拮抗作用的真菌，各真菌對煙草黑脛病菌抑菌率如圖 2，其中抑菌率最大的是 ZP2-4，抑菌率為83.33%。

2.2 形態學鑒定

如圖3所示，5株真菌在PDA平板上均可旺盛生長。ZP2-1的菌落生長迅速，氣生菌絲少，向外輻射生長，孢子淺綠色；菌絲無間隔，分生孢子梗主分枝短，次級分枝直角分布，產孢細胞長瓶形。ZP2-3氣生菌絲豐富，呈散射性生長，后期從中部開始產深綠色孢子；菌絲無間隔，分生孢子梗主分枝長，次級分枝少，單生或間生，近孢子梗頂部不規則伸出，瓶梗基部縊縮，中間膨大，頂部變細。ZP2-4氣生菌絲少，菌落黑色，產黑色孢子；分生孢子呈球形，頂囊球形，分生孢子梗粗。GZ3菌落生長快，質地呈絨狀，中部有厚實孢子層，邊緣為白色氣生菌絲；分生孢子梗光滑，頂囊燒瓶狀，僅上半部產生孢子，分生孢子球形。GZ7氣生菌絲分散生長，菌落棉絮狀，幼期為無色或淺綠色，后期見深綠色孢子產生；分生孢子梗分枝長且豐富，與木霉屬相似，瓶梗燒瓶形。

2.3 18S rDNA序列分析及分子生物學鑒定

提取5株拮抗真菌基因組DNA并以此為模板擴增各真菌18S rDNA，可得出各自大小約為700 bp的條帶。經測序后，將各自序列在NCBI上用Blast分析，選取同源性較高的真菌18S rRNA基因序列作為參比對象，構建系統發育樹如圖4。發現ZP2-1與Trichoderma reesei（AF510497.1）相似性為82%（圖 4a），ZP2-3與Trichoderma koningiopsis(JQ278018.1)相似性為 99%（圖 4b），ZP2-4與Aspergillus niger（HQ600982.1）的同源關系最近（圖4a），GZ3 與Aspergillus fumigatus（KX015959.1）的相似性為 100%（圖 4c），GZ7與Hypocre rufa（JX21089.1）的相似性為97%（圖4d）。結合形態學特征（圖 3）與分子生物學鑒定，ZP2-1為里氏木霉（Trichoderma reesei），ZP2-3為擬康寧木霉（Trichoderma koningiopsis），ZP2-4為黑曲霉（Aspergillus niger），GZ3為煙曲霉（Aspergillus fumigatus），GZ7為紅棕肉座菌（Hypocre rufa）。

圖1 拮抗真菌與煙草黑脛病菌對峙試驗Fig. 1 Results of plate confronting test between antagonistic fungi and Phytophthora nicotianae

圖2 拮抗真菌對煙草黑脛病菌的抑菌率Fig. 2 Inhibitory effects of antagonistic fungi against Phytophthora nicotianae

圖3 拮抗真菌菌落形態與顯微圖Fig. 3 Colony morphology and micrograph of antagonistic fungi

圖4 根據18S rRNA基因序列構建的拮抗真菌與參考類群間的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of antagonistic fungi based on 18S rRNA and reference taxa

2.4 纖維素酶分泌

將5株拮抗真菌活化后，接種至剛果紅纖維素培養基培養3 d后，經剛果紅染色處理及NaCl洗脫后，觀察得出各菌株分解纖維素能力差異明顯（圖5）。ZP2-1在剛果紅培養基上無水解圈產生，說明其分泌纖維素酶能力極弱；GZ3無水解圈產生，但可見有稀疏的菌絲生長；ZP2-3無水解圈產生，但菌落菌絲生長旺盛；GZ7、ZP2-4能出現明顯的水解圈且水解圈大小為GZ7＞ZP2-4。因此，5株真菌分泌纖維素酶能力強弱依次為GZ7、ZP2-4、ZP2-3、GZ3、ZP2-1。

2.5 蛋白酶分泌

各真菌在酪蛋白培養基上28 ℃培養3 d后生長情況如圖6。只有ZP2-4菌落生長與在PDA上生長無差異，可見明顯水解圈。其余真菌生長均有變化，ZP2-1表現為菌絲生長緩慢，菌落向四周擴散，中心產孢子，無明顯水解圈，說明其產蛋白酶量少，僅供自身生長所需。GZ3菌絲生長旺盛，菌落擴散慢，無明顯水解圈。GZ7菌絲稀疏生長，周圍擴散快，邊緣聚集成絮狀，不產孢子，無明顯水解圈。ZP2-3菌絲生長稀疏，周圍擴散，邊緣聚集成絮狀，菌落中心有淺綠色孢子產生。說明5株真菌分泌蛋白酶能力強弱依次為ZP2-4、ZP2-3、GZ7、GZ3、ZP2-1。

圖5 拮抗真菌纖維素酶分泌的檢測Fig. 5 Detection of cellulase secretion with antagonistic fungi

圖6 拮抗真菌蛋白酶分泌的檢測Fig. 6 Detection of protease secretion with antagonistic fungi

2.6 產孢子能力比較

為了進一步探究各拮抗真菌生長能力，為篩選制作菌劑菌種做準備，對各真菌不同發酵時間產孢子能力進行比較。發酵第 8天時 ZP2-1產孢量為1×109個/g，與 ZP2-4、GZ3、GZ7、ZP2-3 產孢量相比分別是其 1.15、1.33、1.81、3.57倍。發酵第10 d時ZP2-4產孢量最大，為2.58×109個/g，顯著高于其余菌株，分別是GZ3、ZP2-1、ZP2-3、GZ7的1.58、2.61、4.16、8.06倍。發酵第12 d時ZP2-4產孢量依然最大，較第10天有所降低；GZ3產孢量較第10天有所上升，但低于ZP2-4；其余3株真菌產孢量與第 10天時相當，維持不變。綜合不同時間點各真菌產孢量的變化，可得出產孢能力大小為 ZP2-4＞GZ3＞ZP2-1＞ZP2-3＞ GZ7（圖 7）。

圖7 拮抗真菌固態發酵產孢子能力比較Fig. 7 Comparison of spore producing ability of antagonistic fungi in solid state fermentation

2.7 固體發酵產物羧甲基纖維素酶活比較

固體發酵培養8 d時，各真菌發酵產物羧甲基纖維素酶活性如圖8所示，ZP2-1 CMC活性最高為388.51 μg/(mL·min)，GZ3 次之為354.60 μg/(mL·min)，ZP2-4 為 336.21 μg/(mL·min)，都顯著高于 GZ7 和ZP2-3（分別為 29.31 和 129.31 μg/(mL·min)；可得出各真菌固態發酵產物CMC酶活大小為：ZP2-1＞GZ3＞ZP2-4＞ZP2-3＞GZ7。

圖 8 拮抗真菌固態發酵纖維素酶活性比較Fig. 8 Comparison of cellulase production by solid fermentation of antagonistic fungi

2.8 田間試驗

綜合各拮抗真菌固態發酵產孢子能力以及固態發酵產物CMC酶活性，選取ZP2-1、GZ3、ZP2-4制成微生物固態發酵菌劑進行試驗。對3種拮抗真菌進行田間防治效果測定，結果表明，3種拮抗真菌對煙草黑脛病均有防治效果（表2），黑曲霉ZP2-4防治效果最佳高達85.00%，木霉ZP2-1為59.50%、煙曲霉GZ3為61.28%，化學藥劑為45.23%。表明黑曲霉ZP2-4防治效果高于化學藥劑，且優于煙曲霉GZ3和木霉ZP2-1。

表2 拮抗真菌對煙草黑脛病的田間防治效果Table 2 Control efficacy of antagonistic fungi against tobacco black shank in the field

3 討 論

木霉被認為是一種重要的植物生防因子，廣泛用于番茄枯萎病菌[17]、番木瓜炭疽病菌[18]、棉花枯萎病菌、萵苣枯萎病菌[19]、水稻惡苗病菌等病原菌引起的植物病害防治[20]，且蔡勇[21]從煙草土壤分離得到2株擬康寧木霉對煙草黑脛病菌具有明顯抑制效果。我們發現其對由煙草黑脛病菌可進行有效控制，因而具有較高的研究價值。

已有研究顯示，煙曲霉對煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)具有穩定的拮抗作用，對煙苗生長無影響[22]；郭夏麗等[23]從染病煙草根際土壤分離篩選出一株對煙草黑脛病菌有明顯抑制作用的煙曲霉，也成功用于煙草黑脛病防治。王巖等[24]將從煙草黑脛病發病嚴重煙株根際土壤分離的黑曲霉Ty-3制成生防制劑應用于田間試驗，可顯著降低煙草黑脛病發病率。本研究的對峙實驗發現，黑曲霉 ZP2-4對煙草黑脛病菌具有很好的抑制效果，且兼有營養要求簡單、生長繁殖快、產孢子能力強等特點。在為煙草黑脛病生物防治提供有益菌種資源，大規模生產綠色環保型菌劑方面潛力巨大。

本次木霉與煙草黑脛病菌對峙實驗中，木霉菌落向外逐漸擴散，最終覆蓋在病原菌表面，表明木霉可迅速占領空間和營養對病原菌形成抑制。高雪麗等從堆肥中分離的側鉤木霉(Trichoderma ghanense)通過同樣的機制對立絲枯核菌(Rhizotonia solani)和腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)產生拮抗作用[25]。黑曲霉ZP2-4、紅棕肉座菌GZ7可水解羧甲基纖維素形成明顯水解圈，說明其可分泌纖維素酶對煙草黑脛病菌產生抑制；黑曲霉在酪蛋白平板上形成明顯水解圈，說明其可分泌蛋白酶對煙草黑脛病菌產生抑制。報道指出黑曲霉既可產纖維素酶[26]也可產蛋白酶[27]，本實驗結果印證了這一結論。對于在纖維素平板和酪蛋白平板上不能形成水解圈但可緩慢生長的菌株，可能是由于病原菌菌絲等誘導其產生少量纖維素酶和蛋白酶[28]所致。對5種拮抗真菌固態發酵產孢能力進行比較，結合固體發酵產物中纖維素酶活性大小選出3株真菌，田間試驗結果顯示，固態發酵產孢多且產物中纖維素酶活性高的黑曲霉ZP2-4的防治效果顯著高于化學藥劑對照和木霉及煙曲霉，說明黑曲霉可作為煙草黑脛病田間防治的一個新的菌種資源，在煙草真菌病害防治中的應用具有巨大潛力。

4 結 論

本研究結果表明，篩選的木霉 ZP2-1、煙曲霉GZ3、黑曲霉ZP2-4對煙草黑脛病有較好的防效，可用于煙草黑脛病生物防治。ZP2-4防效最高，可能與其分泌蛋白酶和纖維素酶能力強、固體發酵產孢量多有關。

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